[发明专利]冷休克蛋白质组合物和用于其用途的方法以及试剂盒

说明书

优先权声明

本申请要求提交于2008年2月29日的美国临时申请号61/067,596，提交于2008年10月9日的美国临时申请号61/195,747，以及提交于2008年5月16日的日本申请号2008-129745的优先权，这些公开的内容在此处全部并入本文作为参考。

序列列表

随本文一并提交书写形式的及计算机可读形式的序列列表。计算机可读形式记录的信息与书写形式的序列列表是相同的。

发明背景

在研究领域，将DNA的合成用于多种目的。其中，除了化学合成短链DNA如寡聚核苷酸之外，通过使用了DNA聚合酶的酶促方法进行DNA合成中的大部分。PCR可在体外容易地扩增所需要的核酸片段，有极高的价值，并已经成为生物学、医学、农业和其他领域中不可缺少的工具。在由PCR扩增DNA的过程中，许多情况下都要求反应的高特异性。尽管开发了新型DNA聚合酶，也优化了反应混合物的组成以减少非-特异性扩增，但是仍然需要对PCR扩增特异性的改进。

除了使用DNA作为模板材料的传统PCR方法之外，还可使用RNA-依赖的DNA聚合酶逆转录酶实现DNA的合成。在研究领域中，常常有必要分析衍生自多种基因的mRNA分子。逆转录酶使得用RNA作为模板合成cDNA的逆转录反应成为可能，并且因此，已经在对mRNA分子的分析上实现了卓越的进步。通过在克隆技术和PCR技术的应用，其中使用了逆转录酶的mRNA分子的分析现在在遗传学研究中是不可缺少的实验技术，并且已经成为多种领域如生物学、医学、农业中绝对必要的技术。

迄今已经产生了一些手段以改进逆转录反应的反应性，例如，已经研究了在高温下进行的逆转录反应过程；在其中使用了逆转录酶以及具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的cDNA合成过程(JP专利号3910015)；其中使用了核酸-结合蛋白质如Ncp7、recA、SSB及T4gp32的过程(WO 00/55307)；等等。尽管有一些对逆转录反应的反应性的改进，然而可能无法合成全长的cDNA，并且甚至在如今，有些情况下所合成的cDNA的量可能不足。因此，对逆转录反应的反应性的改进仍然是正进行的大事，必须要进一步改进。

除了对上文描述的两种DNA合成方法的改进之外，在科学领域还需要可以确定内切核糖核酸酶的切割位点特异性的技术。例如，mRNA干扰酶为存在于广泛的细菌基因组中的毒素-抗毒素系统编码的序列-特异性内切核糖核酸酶。这些内切核糖核酸酶通常具有单链RNA内的特异性切割位点：大肠杆菌(E.coli)MazF在ACA序列处特异性切割，ChpBK在ACY序列处(Y为U、A或G)特异性切割，来自质粒R100的PemK在UAH序列处(其中H为C、A或U)特异性切割，来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的MazF-mt1和MazF-mt6分别在UAC和U富含区域特异性切割。最近，有发现来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的MazF同源物在VUUV’处进行切割(其中V和V’为A、C或G，且可以相同或不相同)。然而确定分支结核杆菌的一些MazF同源物的切割特异性的之前尝试却失败了。尤其是对于确定其中识别长于三个碱基的特异性序列的切割特异性，使用足够长以覆盖所有可能的靶标序列的RNA底物是至关重要的。使用长RNA作为底物的一个主要问题在于尽管其为单链RNA，却形成非常稳定的二级结构。为了使用这种或任何其他长RNA作为内切核糖核酸酶的底物，必须解折叠其二级结构。因此，还有对开发用以确定内切核糖核酸酶如mRNA干扰酶的切割-位点特异性的新技术的需要。

在多种微生物体内发现有冷休克蛋白质，人们认为其在对生长温度下移的适应中起到一些作用。其中，已经鉴定CspA为一种主要的冷休克蛋白质。从大肠杆菌(Escherichia coli)中分离出编码CspA的基因，并使用其基因产生了重组CspA(见WO 90/09444)。然而，冷休克蛋白质的常规提出的应用限于其作为冷冻保护蛋白质的用途，其保护农田中不受冷冻或霜冻损害。

本发明提供了用于改进的DNA合成反应(具有改进的反应性)的包含冷休克蛋白质的组合物，使用这些组合物用于合成DNA的方法，在这些方法中使用的试剂盒，以及通过这些方法产生的组合物。本发明进一步提供用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的包含冷休克蛋白质的组合物，使用这些组合物用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的方法，以及在这些方法中使用的试剂盒。

发明概述