[发明专利]A型肉毒杆菌毒素中和组合物及人抗A型肉毒杆菌毒素抗体

说明书

技术领域

本发明涉及对于A型肉毒杆菌毒素具有结合活性且具有完全人可变区的基因重组抗体、编码该抗体的核酸分子、生产该抗体的转化体、使用该转化体的抗体制备方法以及使用该抗体的A型肉毒杆菌毒素中和组合物等。

背景技术

肉毒杆菌(Clostridium botulinum)产生的毒素根据血清型的不同分类为A型～G型。A、B、E、F型毒素对人健康有重大影响。在人的肉毒杆菌中毒疾病中，有“食物性肉毒杆菌病(肉毒杆菌食物中毒)”、“婴儿肉毒杆菌病”、“创伤型肉毒杆菌病”和“感染型肉毒杆菌病”4种。A型毒素与肉毒杆菌食物中毒的26％有关。A型毒素与肉毒杆菌食物中毒的26％有关。B和E型次之，F型毒素与肉毒杆菌食物中毒的相关比例比较低。另外，有报告创伤型肉毒杆菌中毒只由A型或B型毒素引起(非专利文献1)。

成人的肉毒杆菌食物中毒通常为，菌或芽孢在食品中增殖，结果产生的毒素经口摄取而发病，另一方面，在新生儿肉毒杆菌病中，在蜂蜜等的食品中存在的菌或芽孢经口摄取，结果菌在肠管发育、增殖，并产生毒素，由此引起中毒症状。食物中毒的原因毒素根据国家的不同而异，但有报告A型、B型和E型引起的病例。另外，婴儿肉毒杆菌病的一大半是A型、B型，但也有报告C.butiricum引起的E型毒素、引起的F型毒素。

肉毒杆菌毒素是重链和轻链S-S键合(二硫键)的结构的分子。肉毒杆菌毒素阻滞向肌肉的神经传递，由此引起弛缓性麻痹。如果肉毒杆菌毒素进入气道、呼吸肌，则引起致死性的呼吸障碍。肉毒杆菌中毒导致的死亡率为12％，在特定的危险人群中，死亡率更高(非专利文献3)。

另一方面，由于肉毒杆菌毒素作为生物学毒素是致死性最高的毒素(纯化的A型毒素对70kg的人的致死量为，静注或肌肉注射时为0.09-1.5μg，在吸入时为0.70-0.90&micro；g，经口时为70μg(JAMA.2001Feb28；285(8)：1059-70)，因此除了通常的中毒以外，具备用于生物恐怖的特殊性，在社会上也受到广泛关注。

作为对于肉毒杆菌毒素的中和剂，在日本得到批准的物质是以马血清为原材料的制剂。该制剂为源自马血清的球蛋白，即由于对人是以异种蛋白作为主成分，因此存在引起过敏反应等的免疫反应的危险性。另外，还存在未知病毒感染、血清病的问题。而且，也难以稳定地供给。进而，该制剂的制备需要1年以上，因此存在难以应对生物恐怖等非常时期的情况。此外，由于马的饲养管理存在问题，因此该制剂不适用于储备目的。

对于婴儿肉毒杆菌病，为了避免过敏反应等的严重的副作用，现实情况是不进行利用该马球蛋白制剂的治疗。在美国，利用由使健康人对肉毒杆菌类毒素免疫而得到的中和抗体效价高的血浆调制的人球蛋白制剂，进行对于婴儿肉毒杆菌病的特异性治疗。实际上，“BabyBIG”的商品名下，以婴儿肉毒杆菌病为对象的药品在美国FDA是作为罕用药而批准制造许可的。但是，该方法除了伦理上的问题以外，还存在得到原材料、生物危害的问题，而且从确保安全性的观点考虑，有在制造时必须进行各种病毒检查这样的问题等。另外，在日本，该制剂未得到批准，不能使用。

有报告成功制作对于A型毒素的重组中和嵌合体抗体(专利文献1).但是，在使用该抗体时，必须解决HACA(人抗嵌合体抗体)出现的问题、过敏反应等的问题。

另一方面，在美国，特别是从具备生物恐怖威胁的角度考虑而进行毒素中和的研究开发，尝试由对肉毒杆菌毒素五聚物免疫的人的B淋巴细胞制作噬菌体抗体文库，由其中选择期望的完全人中和抗体的方法。但是，对于A型病毒，没有成功取得单独发挥充分的中和活性的抗体克隆。因此，通过在由噬菌体呈现筛选的结果得到的1种人抗体中，混合源自XENO小鼠的克隆1种，进而混合将通过小鼠免疫得到的小鼠抗体人化得到的抗体(寡克隆化)，从而必须使中和活性强化，尚未达到期望的目的，即通过完全人中和抗体引起的毒素中和(专利文献2、3，非专利文献4、5、6)。

专利文献1：日本特开2006-311857号公报

专利文献2：国际公开第2005/016232号小册子

专利文献3：国际公开第2007/094754号小册子

非专利文献1：H.Sugiyama，Microbiol.Rev.44：419，1980

专利文献2：S.Arnon，Epidemiol.Rev.3：45，1981

非专利文献3：C.O.Tacket et al.，Am.J.Med.76：794，1984