[发明专利]在液体培养基中通过凝集实时检测微生物的方法

说明书

发明领域是临床或工业微生物学检测领域。更特别地，其涉及通过与富集样品中的微生物同时进行的凝集反应鉴别一或多种微生物的方法。

微生物学分析需要精确技术，其中获得结果的时间应该尽可能短。

在医学领域，需要预测和诊断感染风险：诊断越快及越精确，患者治疗越有效及传播风险越低。该方法对于动物健康是类似的。

在食品加工领域，规范是相同的。但是这些规范区分病原微生物及其毒素，这种研究适用于上市产品，非病原微生物，其沿生产线从初级产品至最终产品用作生产方法的质量指标，及技术上如发酵感兴趣的细菌。推测的污染物的快速精确检测使得可以测试它们并且因此启动正确的措施。

技术上，微生物学分析可以实施一或多个阶段的预富集/富集(pré-enrichissement/enrichissement)，一或多个阶段的检测，一或多个阶段的微生物计数。对于特殊应用如食品加工微生物学测试，也可能需要证实阶段，以符合该领域中的强制标准。

预富集/富集阶段需要本领域技术人员熟知的选择性或非选择性培养基。基于常规培养基配方的经常为液体形式的现成使用的培养基是商业可获得的。

检测阶段基于证实待检微生物的代谢特征。常规使用特异的酶底物。这些酶底物通常由两部分组成，第一部分特异于待揭示的酶活性，也称为靶部分，第二部分作用为标记，也称作标记部分，通常由生色团或荧光团组成。通过选择这些底物，根据是否有反应，可以鉴定微生物性质或者区分各种微生物群。因此，颜色或荧光的出现或消失将是微生物属或类型的特征。关于这一点，使用生色培养基使得能同时检测和鉴别待检微生物。其简化了方法并且大大降低了获得结果所需的时间。具体举例可以提及的是申请人的ChromID培养基。这些生色培养基基于检测特异于待检微生物的代谢特征，例如大肠杆菌(Escherichia coli)的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。但是，一些微生物或者一些亚型例如大肠杆菌O157:H7不显示任何特异酶活性，因此不能用生色培养基检测。

证实阶段部分更特别与食品加工领域的微生物学分析相关。具体地，当先前开发方法的结果是阳性时，需要证实存在待检病原体。这意味着需要额外测试及使用不同于第一次分析中使用的检测原理。基于待检微生物的基因组特征的分子生物学技术构成了用于证实所述鉴别的一种手段。例如，可提及的是常规扩增技术如PCR(聚合酶链反应)和NASBA(基于核酸序列的扩增)，它们可以与本领域技术人员已知的实时检测技术结合。

免疫测定构成另一种用于证实测试的技术。它们利用待检微生物的免疫原性特征。非限制性例子为竞争或夹心ELISA(酶联免疫吸附测定)技术或者免疫凝集技术，检测待检微生物的表位。后一方法利用功能化固体支持物如用单克隆抗体或多克隆抗体包被的珠(例如胶乳颗粒)，所述功能化支持物与生物学样品接触，如授权的欧洲专利EP 0 701 624及EP 1 199567所述。或者，如专利US-4,659,658所述，固体颗粒可以用与位于给定微生物表面上的糖特异结合的凝集素包被。在任何情况下，凝集的出现使得可以明确鉴别待检微生物。

样品中微生物的完整精确鉴别因此需要若干步骤顺序：富集、检测、证实。日常使用的测试的标准化已能使检测方法自动化，但是其进行起来还是很慢。现有技术的一个缺点是事实上这些步骤依次进行。另一个缺点是用于证实步骤的特异相互作用反应，其是免疫学反应或者分子杂交反应，通常在“终点”读取。在这期间，在食品加工业，终产品的完整批次被阻断而等待证实结果，在临床时期，相关抗生素治疗和预防措施的建立被延迟。

考虑到现有技术，因此缺少组合了富集、检测和精确鉴别步骤的方法。具体地，这种方法能将快速、特异性和灵敏性组合在一起。

本发明因此通过在液体培养基中同时使用微生物培养物和至少一种凝集反应而克服了上述缺点。

更具体地，本发明首先涉及检测和鉴别可能存在于样品中的至少一种微生物的方法，包括步骤：

a)在容器中将能生长和/或检测微生物的培养基、所述样品及敏化固体支持物接触；

b)将所述全部物质置于促进微生物的生长和/或检测的温度；及

c)当步骤b)已完成时，实时观察凝集的出现，其中当在所述培养基中检测所述微生物时所述凝集的出现指示所述微生物的存在或者证实所述存在。

本发明的另一个主题涉及检测和鉴别可能存在于样品中的至少一种微生物的方法，包括步骤：

a)在容器中将能生长和/或鉴别微生物的培养基、所述样品及敏化固体支持物接触；

b)将所述全部物质置于促进微生物生长和/或鉴别的温度；及