[发明专利]具有乙二醛酶III活性的多肽、编码所述多肽的多核苷酸及它们的用途

说明书

发明领域

本发明涉及一种新的多肽、具有编码所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸及它们的用途，所述多肽具有在单一步骤中将甲基乙二醛(methylglyoxal)转化成乳酸的酶活性(称为乙二醛酶III活性)。

更具体而言，本发明涉及通过改变编码所述多肽的多核苷酸的表达水平来调控(modulate)微生物中的乙二醛酶III活性。

本发明还涉及通过发酵微生物(其中它们的乙二醛酶III活性受到调控)来生产商品化学品(commodity chemicals)，特别是1，2-丙二醇、丙酮醇和乳酸。

现有技术

对葡萄糖的分解代谢可以在数种微生物中导致乳酸(lactate)形成(一般在发酵条件下)。取决于生物体可以形成D-或L-乳酸：D-乳酸在混合酸发酵过程中在大肠杆菌(E.coli)中与其它产物一起形成，而D-或L-乳酸可以通过乳酸细菌的发酵来生成。生成途径源自从葡萄糖生成丙酮酸的糖酵解途径。丙酮酸(pyruvate)可以通过单一反应由可溶性乳酸脱氢酶还原成乳酸，所述可溶性乳酸脱氢酶依赖于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)作为辅因子。在大肠杆菌中，由ldhA基因编码的乳酸脱氢酶对D-乳酸是特异性的(Clark，1997)。在乳酸细菌中，可找到对D-或L-乳酸特异性的乳酸脱氢酶(对于德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)为D-乳酸，对于瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)为L-乳酸，参见例如Garvie，1980)。

在数种生物体中，另一种途径可以负责乳酸生成。此途径称作甲基乙二醛旁路，因为它能充当糖酵解途径下游部分的备选，将丙糖甘油醛-3-磷酸(GA3P)转化成丙酮酸(Cooper，1984)。甲基乙二醛旁路起始于通过切割果糖-1，6-二磷酸产生的第二个磷酸丙糖，即二羟丙酮磷酸(DHAP)。DHAP由甲基乙二醛合酶转化成甲基乙二醛(MG)。然后MG(其是一种对细胞有毒的化合物)由不同系统转化成D-或L-乳酸，并且所产生的乳酸可以由D-或L-乳酸脱氢酶进一步转化成丙酮酸。与发酵性乳酸脱氢酶相比，这些酶是仅在需氧条件下激活的黄素连接的膜结合蛋白(Garvie，1980)。D-和L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中分别由dld和lldD(或lctD)基因编码(Rule等，1985，Dong等，1993)。

已经在细菌中研究了甲基乙二醛的分解代谢路径(Ferguson等，1998)以理解对此化合物的解毒，而且也为了生成1，2-丙二醇。已经在大肠杆菌中鉴定出三种途径，它们可以导致从甲基乙二醛生成乳酸：

-第一种途径是谷胱甘肽依赖性乙二醛酶I-II系统(由gloA和gloB基因编码)，其在两个步骤中将甲基乙二醛转化成D-乳酸。

-第二种是不依赖于谷胱甘肽的乙二醛酶III酶，其在一个步骤中催化甲基乙二醛向D-乳酸的转化。

-第三种系统是甲基乙二醛还原酶对甲基乙二醛的降解，产生丙酮醇或D-或L-乳醛(lactaldehyde)。可以通过醛脱氢酶的作用(例如通过由aldA或aldB基因编码的酶)将L-乳醛进一步转化成L-乳酸(Grabar等，2006)。

乙二醛酶III系统不如乙二醛酶I-II系统研究得广泛。酶乙二醛酶III是由Misra等于1995年在大肠杆菌中首次提及并纯化。此酶与乙二醛酶I显著不同，因为它具有不同的特性，而且能够在单一步骤中催化甲基乙二醛转化为D-乳酸，这不依赖于谷胱甘肽。随后，这种酶在数个报道中提及(MacLean等，1998，Okado-Matsumoto和Fridovich，2000，Benov等2004)具有比大肠杆菌中的乙二醛酶I或乙二醛酶II更高的活性。在此之前，还没有确定乙二醛酶III的氨基酸序列，而且编码此酶的基因是未知的。

1，2-丙二醇或丙二醇(即C3二醇)是一种广泛使用的化学品。它是不饱和聚酯类树脂、液体洗涤剂、冷却剂、航空器防冻和消冰液的成分。自1993-1994年以后，已经越来越多地使用丙二醇作为乙烯衍生物的替代，所述乙烯衍生物被认为比丙烯衍生物更具毒性。