[发明专利]生产含二硫键的蛋白质的宿主细胞和方法

说明书

发明领域

本发明提供了遗传修饰的芽孢杆菌宿主细胞，所述细胞具有降低的细胞质还原酶活性，例如降低的TrxA活性，以及编码异源氧化酶，例如葡萄球菌氧化酶的核酸。本发明还提供了使用本发明的宿主细胞生产含二硫键的蛋白质的方法，以及使用本发明的宿主细胞改进此类含二硫键的蛋白质折叠的方法。

背景

二硫键对自然界发现的大量蛋白质的正确折叠、结构完整性和活性是关键的。在缺少将其半胱氨酸连接至二硫键的正确氧化条件下，这些蛋白质将既不完全稳定，也无生物学活性。重要的是，具有生物药学重要性的许多真核生物蛋白含有多个二硫键。其中包括人胰岛素、胰岛素样生长因子、人生长激素、脑衍生神经营养因子、神经生长因子、脂肪酶、Bowman-Birk蛋白酶抑制剂和抗体片段。

二硫键的形成可以自发产生，但该过程是非常缓慢和非特异的。出于上述理由，进化出了催化二硫键在体内形成(氧化)的酶。这类酶属于硫醇-二硫化物氧化还原酶(TDOR)类。该类酶也含有断裂(还原)或异构化二硫键的酶。细胞质的TDOR通常发挥还原酶的功能，而其胞质外的等同酶则是氧化酶或异构酶(Dorenbos等人，(2005)p.237-269.In S.G.Pandalai(编著)，Recent Res.Devel.Microbiology 9.Research Signpost，Kerala，India；Ritz等人，Annu.Rev.Microbiol.55：21-48.，2001；Tan等人，Chembiochem.5：1479-1487，2004)。酶依赖性的二硫键形成实际上是为何使用细菌细胞工厂仍然难以大量生产含此类键的蛋白质的主要原因。在细菌细胞工厂中，过量生产的蛋白质缓慢和/或非特异的氧化可以导致这类蛋白质缓慢和/或错误的折叠，使其易于被蛋白水解降解，并可能使其失活，除非在体外进一步加工这类蛋白质成为正确折叠的或活性产物。

以前对枯草芽孢杆菌中二硫键形成的研究显示，该生物含有至少4种具有推测的氧化酶活性的TDOR。这类蛋白质称为Bdb(芽孢杆菌二硫键)蛋白，注释为BdbA-D。bdbA和bdbB基因位于SPβ原噬菌体区域，因此只存在于测序的枯草芽孢杆菌菌株168中。已经鉴别了BdbB、BdbC和BdbD的生物学功能，但未鉴别BdbA的生物学功能。发现Bdb的功能是模块化的，即不同的Bdb蛋白可以合作执行不同的功能(Kouwen等人，Mol.Microbiol.64：984-999)。整合膜蛋白BdbB与BdbC共享了高度的序列相似性，且对编码分泌性SPβ的羊毛硫抗生素sublancin 168的折叠是非常重要的，所述羊毛硫抗生素sublancin 168含有两个二硫键(Bolhuis等人，J.Biol.Chem.274：24531-24538，1999；Dorenbos等人，J.Biol.Chem.277：16682-16688，2002；Stein，Mol.Microbiol.56：845-857，2005)。相反，BdbC和BdbD对类纤毛蛋白(pseudopilin)ComGC的生物发生是非常重要的，且对于该过程，BdbB是非必需的(Meima，J.Biol.Chem.277：6994-7001，2002)。ComGC是枯草芽孢杆菌的DNA摄入机器的重要因子，与其折叠成蛋白酶抗性构象所需要的TDOR一致，ComGC含有一个关键性的分子内二硫键(Chung等人，Mol.Microbiol.29：905-913，1998)。枯草芽孢杆菌的分泌性异源蛋白质的折叠也需要BdbC和BdbD，即大肠杆菌的碱性磷酸酶PhoA(Bolhuis等人，J.Biol.Chem.274：24531-24538，1999；Darmon等人，Appl.Environ.Microbiol 72：6876-6885，2006；Kouwen等人，Mol.Microbiol.64：984-999.2007；Meima等人，J.Biol.Chem.277：6994-7001，2002)。该TDOR需求涉及以下事实，即大肠杆菌PhoA含有2个二硫键，它们对该蛋白质的酶促活性和稳定性都是不可或缺的(Sone等人，J.Biol.Chem.272：6174-6178，1997)。综上所述，上述以前的观察结果表明，组合的BdbA-D蛋白提供了含有同源和异源二硫键的蛋白质在枯草芽孢杆菌中折叠的基本机制。