[发明专利]高表达发酵单胞菌属启动子

说明书

相关申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2008年3月27日的美国临时申请61/039871的优先权，该申请以引用方式并入本文。

政府权利声明

本发明由美国政府支持，受与能源部签署的合同号04-03-CA-70224和DE-FC36-03GO13146的约束。美国政府拥有本发明的必然权利。此外美国政府拥有本发明的权利，受美国能源部与美国国家可再生能源实验室(美国中西部研究所的分支机构)签署的合同号DE-AC36-99GO10337的约束。

发明领域

本发明涉及微生物学和基因工程领域。更具体地讲，鉴定了引导细菌中的嵌合基因表达的新启动子。

发明背景

通过微生物来生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因此成为当前研究的重要领域。希望微生物能够利用木糖作为碳源生产乙醇以及其他有用的产物，因为木糖是水解的木质纤维质材料的主要戊糖，因此能提供丰富可用的低成本碳底物。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)和其他乙醇细菌天然不利用木糖，可通过导入基因将它们遗传工程化以利用木糖，导入的基因编码1)木糖异构酶，该酶催化木糖转化成木酮糖；2)木酮糖激酶，它将木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)转酮醇酶；和4)转醛醇酶。

已经成功地工程化了运动发酵单胞菌菌株用于木糖代谢(US5514583、US 5712133、US 6566107、WO 95/28476，Feldmann等人(1992)Appl Microbiol Biotechnol 38：354-361，Zhang等人(1995)Science267：240-243)，以及工程化了棕榈发酵细菌(Zymobacter palmae)菌株用于木糖代谢(Yanase等人(2007)Appl.Environ.Mirobiol.73：2592-2599)。然而工程化菌株通常在木糖上生长和生产乙醇不如在葡萄糖上一样好。就这种工程化而言，编码用于木糖代谢的异源蛋白的基因已经从在运动发酵单胞菌细胞中有活性的启动子上表达，通常是运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子或运动发酵单胞菌烯醇酶基因的启动子。工程化以利用木糖的菌株已经适应在木糖培养基上连续传代，所得菌株具有改善的木糖利用率，如美国专利7,223,575以及共有的和共同未决的美国专利申请公布US20080286870所描述。然而仍未确定该改善的遗传基础。

需要具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属的遗传工程化菌株和其他乙醇细菌。申请人已经发现突变体启动子具有提高的活性，这可用于表达木糖利用基因，其活性赋予包含这些启动子的工程化菌株改善的木糖利用率。该启动子也可用于表达其他基因。

发明内容

本发明涉及分离的突变型启动子，所述启动子用于表达基因，即在发酵单胞菌属、发酵细菌属、以及相关细菌中的嵌合基因，它们引导的基因表达水平比由运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Pgap)的天然启动子引导的基因表达水平更高。该突变型启动子是运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的衍生物，并且由于特定突变的存在而具有提高的活性。该启动子可用于基因工程以表达编码区或表达调控RNA。由这些启动子引导的木糖异构酶的编码区表达导致利用木糖的运动发酵单胞菌在包含木糖的培养基中的生长改善。

本文所述的是包含运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的分离的核酸分子，所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有核苷酸取代；其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译起始密码子。

本文还描述了以下内容：包含上述分离的核酸分子并可操作地连接至异源核酸分子的嵌合基因；包含上述核酸分子的载体以及对包含导入到细胞中的上述核酸分子的细菌细胞进行基因工程化的方法。

附图简述和序列描述

可通过下列发明详述、附图、以及结合作为本专利申请一部分的序列描述，能更全面地理解本发明的多个实施方案。

图1示出转酮醇酶(A)、转醛醇酶(B)、木糖异构酶(C)、和木酮糖激酶(D)的酶检测分析方法。

图2是在用PgapxylAB转化的T2C、T3C、T4C、和T5C品系中的木糖异构酶(XI)和木酮糖激酶(XK)的活性示意图。