[发明专利]用于非常规可传播因子的体外检测和/或滴定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于非常规可传播因子(NCTA)相关感染性的体外测定的方法及其应用，特别是用在体外评估和/或监测用于获得或处理生物学样品的方法的有效性的方法中，或用在消除污染步骤的体外评估和/或监测方法中，或用在体外评估化合物调节NCTA相关感染性的能力的方法中。

背景技术

可传播海绵状脑病(TSE)将许多以中枢神经系统(CNS)退化为特征的遗传性或获得性疾病合并为一组。在人类中最常见的形式是克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)(CJD)，但是TSE也存在于许多哺乳动物中(特别是绵羊中的瘙痒病和牛海绵状脑病)。这些疾病的病原因子被分类在“非常规可传播因子”(NCTA)类别中。疾病的标志是存在被称为朊病毒蛋白(PrP)的细胞外蛋白，该蛋白在疾病过程中被转变成对蛋白酶例如蛋白酶K具有抗性的不溶形式，并在中枢神经系统中积累。这种被称为PrPsc的病理学异常形式的PrP与感染性共纯化，并且其积累在时间上先于组织学病变的出现。它源于PrP朊病毒蛋白构象的改变。已经证实编码PrP的基因表达没有改变，其翻译也没有任何损伤(Prusiner，Biochemistry 1992；31；12277-88)。

目前可以获得的数据还不能证明在血液衍生物中发现了感染形式的造成TSE的可传播因子(Brown et al.，2001，Semin Hematol.；38(4Suppl 9)：2-6)。

但是，不能做出它不存在的结论，这种不确定性首先是由于血液中可能非常低的浓度，其次是由于这些疾病在临床征兆出现之前特征性的非常长的无临床症状潜伏期。

此外，NCTA不寻常的抗性阻止了对常规使用的失活方法例如吐温-TNBP溶剂/去污剂处理的依靠，所述处理方法已被证明能够有效降低血液衍生物例如低温沉淀血浆蛋白(因子VIII，von Willebrand因子等)的病毒载量。因为考虑到治疗性应用，生物学样品例如血浆凝结蛋白的获得或治疗应该包括病毒消除/失活步骤，因此制造血液衍生药物的制药工业如今正在设法评估变体CJD通过血液衍生制品传播的理论风险。

目前，常规使用的用于NCTA相关感染性的滴定方法通过脑内注射各种稀释度的载有NCTA的测试产品使用体外滴定方法(例如金色仓鼠用于滴定与263k毒株相关的感染性)。根据对应于所执行的稀释的各种不同组中受感染动物的数量，有可能计算出感染性滴度并在未治疗参照组的基础上建立起给定方法的降低系数。但是，这种方法具有时间长(约1年)、昂贵以及相对来说与需要尽可能快地获得朊病毒消除效率相关结果的工业规模开发不相容的缺点。

此外，为了增加滴定方法的灵敏度，通常需要引入浓缩感染性因子的步骤。目前所有用于浓缩造成TSE的感染性因子的步骤都包括PrPsc的纯化。

已经提出了用于TSE感染性因子的体外滴定的其他方法。

通过Western印迹法(MacGregor，Transfusion J.Medicine 2001；11，3-14)或通过ELISA检测PrPsc的技术一般需要用蛋白酶K预先消化待分析样品或用离液剂进行变性，以便将病理性蛋白(PrPsc)与正常蛋白(PrP)区分开。

最近，基于使用不识别PrP的PrPsc特异性抗体，已经开发出另一种滴定方法(Korth等，Nature 1997 Nov 6，390(6655)；74-7)。

美国专利6,150,583在其一部分中，描述了表达用异源表位标记的PrP的转基因动物的生产，所述异源表位根据朊病毒蛋白的构象而暴露或不暴露在朊病毒蛋白的表面上。

文件WO 2005/022148描述了被称为“TCIA”(“组织培养物感染力测定法”)的生物制品中NCTA的体外滴定方法，所述方法为将耐受所述NCTA复制的稳定的转基因细胞与生物制品相接触，然后将这些细胞培养一代或多代，以便通过NCTA的复制扩增生物制品中存在的NCTA的量。更具体来说，TCIA包括将感染性匀浆液(瘙痒病毒株127-S)的连续稀释液与多孔板上培养的细胞，以每个稀释度5个孔的比例进行接触。然后通过在8到10代后检测PrPsc(与感染性不可分离的标志物)来评估阳性细胞的数量，并通过Spearman-Karber方法确定滴度。

在Saborio等的文献(Nature；2001，411，810-3)中描述的被称为“PMCA”(蛋白错折叠循环扩增)的方法，在其一部分中设想了将源于来自被污染动物的组织或流体的病理形式与非病理形式的NCTA蛋白相接触，以便将后者转变成病理形式。