[发明专利]组合物、方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及用于确定包含交叉反应抗原决定簇的免疫交叉反应分子的组合物和方法，尤其用于确定包含交叉反应抗原决定簇的蛋白质的组合物和方法，尤其用于确定基于血清筛选使用连续免疫激发动物的交叉反应蛋白质，包括确定交叉反应副猪嗜血菌(H.parasuis)蛋白质的组合物和方法。也提供使用该分子诊断的组合物、疫苗及试剂盒，以及用于预防或治疗与传染原相关的疾病、病症、状况、或其症状的方法，该传染原尤其是有传染性的微生物，尤其用于预防和治疗与副猪嗜血菌感染相关的疾病、病症、状况、或其症状的方法。

发明背景

接种疫苗的原理实质上基于两个免疫关键因素，即特异性和记忆。B细胞对大部分抗原应答的激活和分化需要多种信号驱使B细胞形成抗体分泌浆细胞或记忆B细胞，其为介导第二次暴露于抗原的更迅速的应答做准备。记忆细胞允许免疫系统在第二次遇到抗原时发动强烈的多的应答。这种二次应答比初次应答出现的不仅更快而且更有效。然而，由于抗体本性是非常特异的，并且考虑到传染原的多样性，开发在许多不同类型的病原体之间或之内表现出交叉反应的抗体仍然是重要问题。

对于开发表现交叉反应抗体仍然是重要挑战的传染原的一个例子是副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)，其是猪多浆膜炎和关节炎(格拉瑟病)的病原。副猪嗜血菌是革兰氏阴性、偶尔有荚膜的、不动的、多形细菌，从患浆液纤维蛋白性的胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎的猪的浆液性渗出物分离。此生物最初由在1910年描述，似乎1922年第一次由Schermer和Ehrlich分离，尽管所怀疑的生物最初被称为猪嗜血菌(Haemophilus suis)。然而，在1969年，Biberstein和White表明格拉瑟病的病原体仅需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。猪嗜血菌是一种既需要铁卟啉又需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的生物，因此在此疾病中不是潜在因素，新的生物通过添加前缀“副(para)”被重新命名为副猪嗜血菌(H.parasuis)。

在过去五十年间对副猪嗜血菌的表征已有重大进展。Bakos等人使用沉淀测试鉴定四种血清型，他命名为A-D(Nordic Veterinary Medicine，4：241-255(1952))。在1986年这四种增长到七种(J Clin Microbiol，23：1022-1025(1986))。Kielstein等人，Zentralbl Veterinarmed B，38：315-320(1991)另外添加了六种，Rapp-Gabrielson，Am J Vet Res，53：659-664(1992)的工作又添加了另外五种。最后对此分类进行了改进。所有血清型，包括具有多个命名的少数几个，基于通过特异性兔血清进行的免疫扩散测试进行表征。结果是至少十五种血清型的名单，其已经被全球接受。不幸的是，也存在大量未分类的分离菌。此外，许多出版物已经描述了副猪嗜血菌在具体国家中的血清型谱。已经提出在美国、德国、日本、西班牙、加拿大和中国，血清型4和5是非常常见的。已经报道血清型5和13在澳大利亚和丹麦流行。

尚未确定副猪嗜血菌的毒力因子。将毒力大部分与血清型相关联，因为有些与较高的发病率与死亡率相应。腹膜内感染时，已经报道血清型1、5、10、12、13和14在四日内导致高发病率与死亡率。因此，这些株被认为是高毒力的。三种血清型(即2、4和15)显示中等水平的毒力，导致多浆膜炎而无死亡。剩余血清型被认为是无毒力的，因为受感染的猪不显示临床疾病。

已经尝试确定副猪嗜血菌的特异性毒力因子。作为巴斯德菌科(Pasteurellaceae)的成员，人们认为一些候选者将包括荚膜、菌毛、脂多糖(LPS)，以及外膜蛋白(OMP)。然而，目前，在副猪嗜血菌中，人们很少能将这些特性与毒力联系起来。有荚膜的菌株在健康猪和有临床表现的动物的鼻腔中都是常见的。报告显示LPS的产生在有毒和无毒血清型之间无显著差异，并显示含有LPS和OMP两者的递呈仅仅诱导对OMP的应答，这在一定程度上表明LPS是不重要的。

已经表明OMP产生强烈的体液应答，并且已经提出对来自此类型的保护性免疫原候选者。存在两种普遍的OMP谱并可能与毒力相关。最大毒力血清型通过第二种谱表征，其主要是37kDa的蛋白质。无毒血清型显示多个条带，强条带在23-40kDa之间，以及大约68kDa的蛋白质。