[发明专利]作为抗疟剂的RNA适体的筛选

说明书

技术领域

本发明涉及用作抗疟剂的针对恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)红细胞膜蛋白1(PfEMP1)保守区的特定RNA适体。此外，本发明涉及该适体用于诊断相对于不太严重疟疾的严重疟疾的用途。

发明背景

适体是通过不同于典型沃森-克里克碱基配对的相互作用对分子具有特异结合亲和力的核酸分子。

与通过噬菌体展示产生的肽或单克隆抗体(“mAb”)一样，适体能够特异性结合到选定的靶，并调节靶的活动或结合相互作用，例如，通过结合适体可以阻断它们的靶发挥作用的能力。通过随机序列寡聚核苷酸库的体外(in vitro)筛选过程而发现，已经产生包括生长因子、转录因子、酶、免疫球蛋白和受体在内的超过130种蛋白质的适体。典型的适体大小为10-15kDa(20-45核苷酸)，以纳摩尔至亚纳摩尔的亲和力结合其靶，并且区别对待密切相关的靶(例如，适体通常不结合来自相同基因家族的其它蛋白质)。一系列结构研究显示适体能够利用促进抗体-抗原复合物亲和力和特异性的相同类型的结合相互作用(例如，氢键结合、静电互补、疏水接触、空间排斥)。

适体具有许多用作治疗剂和诊断剂所需的特征，包括高特异性和亲和力、生物效能和优异的药代动力学性能，此外，它们提供超过抗体和其它蛋白质生物物质(biology)的特定的竞争优势，例如：

1)速度和控制。适体是通过完全的体外方法生产的，允许起始先导序列(lead)，包括治疗先导序列的快速生产。体外筛选使适体的特异性和亲和力得到严格控制，并允许先导序列，包括抗毒性和非免疫原性靶两者的先导序列的生产。

2)毒性和免疫原性。作为一个类别，适体显示出治疗可接受的毒性并缺乏免疫原性。然而许多单克隆抗体的功效能够受到对抗体自身的免疫反应的严重限制，但引发抗适体的抗体是极其困难的，很可能是由于适体不能经MHC由T细胞递呈和免疫反应通常被训练为不识别核酸片段。

3)施用。尽管多数当前批准的抗体治疗剂通过静脉输注施用(通常地超过2-4小时)，但适体能够通过皮下注射施用(猴子研究中经皮下施用的适体生物利用率为＞80％(Tucker et ah，J.Chromatography B.732：203-212，1999))。具有良好的溶解性(＞150mg/mL)和相对低的分子量(适体：10-50kDa；抗体：150kDa)，适体一周的剂量可通过以小于0.5mL的体积注射来递送。此外，适体的小尺寸允许其渗入到对抗体或抗体片段不允许渗透的构造收缩区(conformational constriction)，显示出基于适体的治疗或预防的另一优点。

4)可规模化和成本。治疗性适体是化学合成的，因此能够根据需要容易地规模化以满足生产需求。尽管当前规模生产中的困难限制了一些生物物质的利用率，并且大规模蛋白质生产工厂的资本成本是巨大的，但是单个大规模寡核苷酸合成仪能够生产达到100kg/年，并要求相对适中的初期投资。当前对于千克规模的适体合成的产品成本估计为$500/g，与高度优化的抗体的产品成本相当。五年内期望在方法开发方面的持续改善使产品成本降低到＜$100/g。

5)稳定性。治疗性适体是化学稳固的。暴露于因素如热和变性剂后，它们本质上适于恢复活性，并且作为冻干粉末能够在室温下长期储存(＞1年)。[0010]而且，适体发现过程容易地允许先导序列修饰，如适体序列优化和适体长度最小化[Conrad等人，1996，Eaton等人，1997]。此外，可利用2′修饰如2′-氟代和2′-O-Me来稳定化以防核酸酶，而不损害适体与靶的结合相互作用。参见例如Lin等人，Nucleic Acids Res.22，5229-5234(1994)；Jellinek等人，Biochemistry 1995，34，11363-1137；Lin等人，Nucleic AcidsRes.，1994，22，5229-5234；Kubik等人，J Immunol.，1997，159(1)，259-267和Pagratis等人，Nat.Biotechnol.，1997，1，68-73。