[发明专利]微生物检测和计数

说明书

本发明涉及检测和计数样品中物种嗜肺军团杆菌(Legionellapneumophila)存活微生物的方法。本发明也包括适用于此方法的试剂盒。此方法和试剂盒使存活微生物的定量更快速。

军团杆菌(Legionella)细菌在潮湿或湿润环境例如土壤和非海水生生境中普遍存在。也可以在温水和冷水设施、空调系统的冷却塔和加湿器中找到它们。

军团杆菌特别是嗜肺军团杆菌是病原体，可引起急性细菌性肺炎，通常称为“军团病”，在感染的个体中经常是致命的。

嗜肺军团杆菌的传统检测和计数是通过细胞培养进行。此方法可使用平板计数通过测量可培养的细菌进行，或应用滤过膜方法测量微菌落进行。这些技术通过存活细菌形成菌落或微菌落的能力评估存活细菌。不幸的是，这些方法通常需要3至10天以形成菌落或微菌落。当用水装置仍然在运行时，在这期间存在感染人的不可接受的风险。

检测总军团杆菌微生物的其他方法包括PCR(聚合酶链式反应)技术。PCR应用DNA聚合酶通过体外酶促复制扩增一段DNA。在技术进行中，生成的DNA作为复制的模板使用从而导致DNA模板指数扩增的链式反应。PCR通过生成百万或更多拷贝的DNA段使单个或较少拷贝的一段DNA扩增。一般的这些方法在Diederen等人，J Med Microbiol.2007 Jan；56(Pt1)：94-101中描述。

然而PCR的一个缺点是样品容易包含聚合反应抑制剂，因此不能一致的提供量化结果。此外，该技术依赖于之前的DNA纯化步骤，所述步骤可导致DNA的损失从而导致低估存在的军团杆菌。在一定程度上定量实时PCR克服了这些缺点。然而，该技术不能区分存活细胞和非存活细胞。

另一个技术是荧光原位杂交(FISH)，其中荧光物质标记的寡核苷酸探针渗入细菌细胞。其中核糖体核酸(rRNA)具有针对探针的正确序列即靶标，探针将与其靶标吸附，并且在任意后续清洗步骤中不被去除。固定了探针的细菌之后将发射荧光信号。此荧光信号可通过例如流式细胞术、固相细胞术或表面荧光显微镜技术(epifluorescent microscopy)定量。一般的FISH技术在Dutil S et al J Appl Microbiol.2006May；100(5)：955-63中描述。然而，单独使用FISH技术可检测存活的嗜肺军团杆菌总数，但不幸的是该方法无法专门鉴定能够分裂并从而形成菌落的嗜肺军团杆菌细菌。

计数存活嗜肺军团杆菌的另一个方法涉及ChemChrome V6，在Delgado-Viscogliosi等，Appl Environ Microbiol.2005Jul；71(7)：4086-96中描述。此方法允许量化嗜肺军团杆菌，并能够区分存活和非存活细菌。此方法结合了用抗体和细菌存活标记(ChemChrome V6)特异性检测军团杆菌细胞和应用表面荧光显微镜术计数。然而，尽管此技术可区分存活和非存活细胞，但不能单独鉴定那些形成菌落的细菌。

US 20070218522描述了检测和定量存活军团杆菌和其他异养需氧细菌的方法和组合物，所述方法包括使用包括吸收性培养基、生长促进和生长选择性物质的蘸片快速检测和定量军团杆菌微菌落。此技术不能计数损伤的细菌。

EP 1329515涉及检测包含过氧化氢的气态环境中微生物存在的方法，通过将气态环境与包含丙酮酸盐的琼脂生长培养基接触，允许微生物菌落的发展。

一般认为涉及在生长培养基例如营养琼脂板上生长菌落的技术更准确。因此平板计数方法仍然是获得总活菌数的优选方法。这一般表示将疑为包含微生物的样品应用于包含固体营养来源或生长培养基的平板上。这一技术一般称为平板接种。提及总活菌数，我们的意思是能够产生观察者可识别群体的细菌总数。一般的这表示在生长培养基例如营养琼脂板表面的可见菌落。

然而，环境中的微生物例如嗜肺军团杆菌可能经受一种或多种阻碍微生物在其环境条件下生长和繁殖的胁迫。这些受胁迫的微生物在常规培养条件下完全不会分裂或不形成可见菌落。在环境中一部分微生物细胞一般会承受由于环境条件例如饥饿、杀生物剂的存在、热休克和干燥的压力。此外，这些细胞可能处于脆弱的生理状态，平板接种微生物技术可能加重已经受胁迫的微生物的胁迫，原因是大气中氧气的存在。此外这可能导致受胁迫细菌的人为死亡，从而导致总活菌数的低估。

此外，由于其致病性，平板接种方法导致的存活嗜肺军团杆菌的低估可能是危险的。