[发明专利]副鸡禽杆菌抗体的检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及副鸡禽杆菌抗体的检测方法和检测试剂盒。具体来说，本发明涉及：副鸡禽杆菌抗体的检测方法，该方法包含通过ELISA法检测由副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum，以下也称为A.pg。旧名为副鸡嗜血杆菌(Hemphilus paragallinarum))A型菌和/或C型菌的菌体外膜蛋白(以下也称为“HMT p210多肽”)诱导的抗体，其中，所述ELISA法以含有该外膜蛋白的非同源区域或其一部分氨基酸序列的肽作为固相抗原；以及该方法中使用的检测试剂盒。根据构成该肽的氨基酸残基数，肽以二肽、三肽、寡肽、多肽等名称称呼，本发明中不对它们进行区别，均定义为肽。

背景技术

由于感染A.pg而发病的鸡传染性鼻炎是鸡的重要的呼吸系统疾病。鸡传染性鼻炎发病鸡的主要症状是鼻液流出、呈现颜面肿胀或者流泪。鸡传染性鼻炎导致鸡的生长率降低、产蛋开始的延迟、产蛋率降低或产蛋停止，其经济损失较大。

Page等人将A.pg分类为A、B和C型三种型(非专利文献1)，Sawata等人将其分类为1型和2型两种型(非专利文献2)。之后，Kume等人报道：Page等人的A型相当于Sawata等人的1型，Page等人的C型相当于Sawata等人的2型(非专利文献3和4)。目前，A.pg的A型(1型)菌(以下也称为“A.pg-A型菌”)和C型(2型)菌(以下也称为“A.pg-C型菌”)成为鸡传染性鼻炎的主要病因菌。

关于鸡传染性鼻炎的预防，以往广泛使用将A.pg-A型菌或A.pg-C型菌的菌体用福尔马林、硫柳汞(thimerosal)等灭活得到的疫苗。但是，在给予这些疫苗时，存在在接种鸡的局部形成坏死病灶(非专利文献5)等的副作用的问题，人们强烈期望开发安全性高的疫苗。

在上述状况下，人们开发了以下的疫苗等：组分疫苗(component vaccine)，只从菌体或培养上清中取出保护性抗原(protective antigen，感染防御抗原)即有效成分(component，组分)，制成疫苗；重组疫苗，通过基因重组技术克隆编码保护性抗原的基因，使该基因在细菌、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等中表达，纯化大量表达的表达产物，将其作为疫苗；或者是载体疫苗，将编码保护性抗原的基因插入到病毒载体等中。

例如德永等人从A.pg-A型菌的培养液中诱导生成红细胞凝集抑制抗体(HI抗体)，成功地纯化了可防御A.pg-A型菌引起的鸡传染性鼻炎的、来自该A型菌的分子量约130kDa的多肽(专利文献1)。并发现，克隆编码该130kDa多肽的DNA片段并在大肠杆菌中表达的该重组蛋白可以防御副鸡禽杆菌A型菌引起的鸡传染性鼻炎的感染。进一步以编码130kDa多肽的DNA片段作为探针，鉴定了HMT p210基因，该基因编码含有2,042个氨基酸的A型HMT p210多肽(具有红细胞凝集活性的菌体外膜蛋白)。还同样地从C型菌中克隆了与该DNA片段杂交的DNA片段，获得了来自C型菌的C型HMT p210基因(专利文献2)。还有报道称，将A型菌和C型菌的HMT p210基因的开放阅读框(ORF，open reading frame)的核苷酸序列进行比较，两者的同源性占全体的80％，5’一侧的约3.4kbp的区域(以下称为区域1)和3’一侧的约1.2kbp的区域(以下称为区域3)具有非常高的同源性，由两个区域夹持的约1.5kbp的区域(以下称为区域2)则同源性低(专利文献2)。

据野吕等人的报道，德永等人发现的HMT p210基因作为型特异性的疫苗的靶区域是很重要的。野吕等人还报道：通过将编码A.pg-A型HMT p210多肽的HMT p210基因的一部分即由4,801bp～5,157bp的DNA片段所编码的肽免疫鸡，则该肽具有诱导对A.pg-A型菌的HI抗体以及疫苗的效果(专利文献3)。另外，野吕等人在第143回日本兽医学会(2007年4月3～5日举办，日本)上报道：通过将编码C型HMT p210多肽的HMT p210基因的一部分即由5.5kbp的DNA片段HPC5.5所编码的肽免疫鸡，同样具有诱导对A.pg-C型菌的HI抗体和疫苗的效果。