[发明专利]配对末端测序法

说明书

发明领域

本发明涉及核酸测序、基因组测序和将测序结果装配成邻接序列的领域。

发明背景

对大的靶核酸(例如人基因组)进行测序的一种方法是使用鸟枪法测序。在鸟枪法测序中，使靶核酸片段化或亚克隆产生一系列的重叠核酸片段后，测定这些片段的序列。根据每个片段的序列的重叠和对每个片段的序列的认识，可以构建完整的靶核酸序列。

鸟枪法测序的一个缺点是如果靶核酸序列包含许多小的重复序列(串联重复序列或反向重复序列)，则装配可能十分困难。不能用重复区装配基因组序列导致装配序列中出现缺口(gap)。因此，在最初的核酸序列装配之后，需要补平序列覆盖范围的缺口，而且还需要解决装配中不确定性的问题。

一种解决这些缺口的方法是使用较大的克隆或片段来测序，因为这些较大的片段可能足够长到跨过重复区。然而，核酸大片段的测序在现有的测序仪中较困难并且耗时。

另一种跨越序列中的缺口的方法是确定大片段两个末端的序列。与鸟枪法测序片段的一个末端的单一序列读长(sequence read)相比，两个末端的一对序列读长具有已知的间距和方向。使用相对长的片段还有助于含有散布重复元件(interspersed repetitive element)的序列进行装配。这一类型的方法(Smith，M.W.等，Nature Genetics 7：40-47(1994)在本领域称为配对末端测序法(paired end sequencing)。本发明包括用于配对末端测序方法和其它核酸技术的新的方法、系统和组合物。

发明概述

本发明的一个实施方案涉及用于在体外反应中获得包含靶核酸的两个末端区的DNA构建体的方法，所述靶核酸可以是得自生物基因组的大区段。所述方法包括下列步骤：

本发明描述了用于在体外反应中获得包含靶核酸的两个末端区的DNA构建体的方法的一个实施方案，所述方法包括以下步骤：使大核酸分子片段化产生靶核酸分子；使重组衔接子元件(adaptor element)与靶核酸分子的每个末端连接产生衔接的靶核酸(adapted target nucleic acid)分子；使衔接的靶核酸暴露于位点特异性重组酶，从衔接的靶核酸产生环状核酸产物和线性核酸产物，其中环状核酸产物包含靶核酸分子；使环状核酸产物片段化产生包含得自靶核酸分子每个末端的序列区的模板核酸分子。

在一些实施过程中，所述方法还包括使用外切核酸酶除去非环状分子的步骤。另外，在一些实施过程中，所述方法还包括以下步骤：将大量环状载体DNA分子(carrier DNA molecule)加入环状核酸产物中；使环状核酸产物和载体DNA分子片段化产生模板分子和大量的线性载体分子；测定自模板分子和线性载体分子片段化的效率；使模板分子扩增以产生包含大量基本相同拷贝的群体，其中线性载体分子是不可扩增的；对所述群体进行测序，生成包含模板核酸的序列组成的序列数据。

本发明的方法可同时在大量靶DNA片段中进行以产生DNA构建体的文库，所述构建体含有来自大的DNA片段的末端。本发明的一个优势是可在体外构建文库而无需使用原核或真核宿主细胞。

因此，本发明涉及用于在体外反应中获得包含靶核酸的两个末端区的DNA构建体的方法，所述方法包括以下步骤：

-使核酸片段化产生靶核酸分子；

-使重组衔接子元件与靶核酸分子的每个末端连接产生衔接的靶核酸分子；

-使衔接的靶核酸暴露于位点特异性重组酶中，由衔接的靶核酸产生环状核酸产物和线性核酸产物，其中环状核酸产物包含靶核酸分子；和

-使环状核酸产物片段化产生包含得自靶核酸分子每个末端的序列区的模板核酸分子。

片段化的核酸可由非常大的分子组成。例如，所述核酸可以是基本上未剪切或之前未被预片段化的基因组DNA。在这种情况下，所述新的方法尤其适用于包含长度选自至少3Kb、至少8Kb、至少10Kb、至少20Kb、至少50Kb和至少100Kb的靶核酸分子。

可用于本发明所述情况的位点特异性重组酶的一个突出实例是Cre重组酶。