[发明专利]人工蛋白支架

说明书

发明领域

本发明一般涉及人工蛋白支架及其设计、生产和用途。尤其是，本发明涉及衍生自蛋白质TOP 7折叠的人工蛋白支架。

背景技术

自然界已提供了可以嵌入各种序列的短肽的许多蛋白质。抗体是众所周知的实例，并且具有由重链和轻链可变区定义的抗原结合结构域，其中每一可变区包括插在构架区(FR)之间的互补决定区(CDR)。抗体重链和轻链两者的CDR3环(loop)是通过如下过程形成的：其中外切核酸酶和末端转移酶运作以将编码肽环的基本上随机的DNA序列插入各V基因中。当该过程与存在于CDR1和CDR2环中的较为受限的多样性联合时，VH和VL结构域随机配对，产生十分大数量的特异性蛋白质序列。所得的这些天然蛋白质显示极大多样性的结合特异性。抗体V结构域的所谓FR可以有效地充当支架，在其上融合CDR环。

然而，抗体存在着许多必须解决的技术问题。例如，它们通常必须在哺乳动物细胞中生成，这是昂贵且耗时的。此外，用于产生单克隆抗体的各种方法通常是缓慢的、昂贵的或两者兼有。由于这些问题，各个团体已在开发用于展示肽的备选蛋白质支架。例如，LaVallie等人((1993)Biotechnology 11：187-93；和美国专利号5,270,181)使用大肠杆菌硫氧还蛋白以避免包涵体形成的方式在大肠杆菌中展示肽。Colas等人((1996)Nature 380：548-50)扩展了这种方法，其证实可以将随机肽插入硫氧还蛋白的天然环中，并且硫氧还蛋白质-肽“适体”(aptamer)可以通过其与各种蛋白质的结合特异性来选择。其他团体已鉴定了其它可用作支架的天然蛋白质。然而，这些方法具有某些局限性。一般而言，基于天然存在蛋白质的支架在通常生成该天然蛋白质的系统中表达最好。例如，基于硫氧还蛋白的适体通常在大肠杆菌中表达。与之相反，基于III型纤连蛋白的适体通常在哺乳动物细胞中和/或使用促进二硫键形成的分泌系统时得到最好地表达。此外，天然蛋白质作为支架的使用总是具有一个固有风险，即天然蛋白质的未知生物特性将干扰在特定的情况下其作为支架的功能。因此，本领域中对具有改良性质的蛋白质支架系统存在需求。

发明概述

本发明部分基于以下认识：，从头设计的完全人工蛋白可以具有蛋白质工程师基于其预期用途的需要而指定的性质。本发明的核心是掺入或模拟Top7蛋白质的元件的人工蛋白(Top7蛋白是一种由Kuhlmann等人(2003)Science 302：1364-1368从头设计的高度稳定的蛋白质)。这些人工蛋白经设计而高度稳定且有效折叠，在某些位置可以遗传掺入随机或多样的肽环。这些人工蛋白支架的稳定性使得可以掺入可能倾向于使蛋白质不稳定的肽，从而允许蛋白质在尽管存在可能的失稳定性环的情况下折叠。如果引入随机化的氨基酸序列的话，则可以就结合预选靶分子的能力，筛选所得的蛋白质文库。由此类筛选得到的蛋白质可以用于诊断和治疗。

因此，在一方面，本发明提供具有Top7折叠的蛋白质。

Top7为球状蛋白质折叠(Kuhlman等人，2003，Science 302，1364)且具有下列氨基酸序列：

DIQVQVNIDDNGKNFDYTYTVTTESELQKVLNELKDYIKKQGAKRVRISITARTKKEAEKFAAILIKVFAELGYNDINVTFDGDTVTVEGQLE(Fig.5)

Top7折叠中的一个或多个环可以特异性地与预选靶分子结合，且该蛋白质与该预选靶分子结合的解离常数不超过10μM(例如5-10μM、1-10μM、0.5-10μM、0.1-10μM、0.05-10μM、0.01-10μM、0.001-10μM等)。

在另一方面，本发明提供了以Top7折叠规定两端的蛋白质。在该蛋白质的一端上的至少两个环各比对应的Top7环长至少一个氨基酸。在一个实施方案中，这两个环中的一个或两个环均特异性地与预选靶分子结合。在某些实施方案中，该蛋白质与预选靶分子结合的解离常数不超过10μM(例如5-10μM、1-10μM、0.5-10μM、0.1-10μM、0.05-10μM、0.01-10μM、0.001-10μM等)。