[发明专利]层析介质

说明书

发明领域

本发明涉及层析法领域。更精确地，本发明涉及一种新型层析介质，即，一种提供有不同的盖的疏水性介质，由于疏水性介质的孔隙率和/或盖的孔隙率，排除超过一定尺寸的分子。

在生物技术中，迄今为止提出的层析法基于与目标的相互作用的不同的模式。因此，例如，在离子交换层析法中，官能团为与其相反电荷的反荷离子永久结合的离子基团，而在疏水性相互作用层析法(HIC)中，固定相与待分离的组分之间的相互作用基于疏水性。

基于疏水性相互作用的层析法通常分为命名为HIC和RPC的两种类型。

HIC是指使用非常亲水性的基质的蛋白质的疏水性相互作用层析法，其中疏水性配体与蛋白质的固定化程度非常低，以避免已分离的蛋白质变性。为了吸附待分离的蛋白质，需要在水中使用高浓度的无机盐。通常通过在洗脱步骤中逐步降低离子强度来实现解吸。

RPC是指使用与疏水性非极性分子/配体(通常为包含4-18个碳原子的脂族碳链)官能化程度非常高的基质(通常基于二氧化硅)的层析法。通常无需加入盐可实现吸附。最常通过逐步增加在洗脱溶液中有机溶剂的含量来进行解吸或洗脱。

含有18个碳链的RPC介质与蛋白质牢固结合。在结合过程中蛋白质也有不同程度的变性。为了洗脱蛋白质，需要使用特别的条件。但是，具有较短链(4个碳)的RPC介质可与包含添加剂(例如三氟乙酸)的基于水/乙腈的洗脱液一起使用，用于蛋白质分离。

固定相(也称为分离基质)包含载体和与载体偶联的配体，所述载体通常为许多基本上为球形的颗粒。在大多数分离基质中，载体具有多孔性，以在每个颗粒中允许较大量的配体，因此具有更多结合的目标化合物。载体最通常为天然或合成的聚合物，并且可采用多种不同的方式来生产球形颗粒。也使用二氧化硅和玻璃珠。常用于该目的的天然聚合物为多糖葡聚糖和琼脂糖。

对于通过层析和分批法分离生物分子，基质(珠、整料、填充膜，等等)的孔隙率非常重要。聚合物介质的优点在于容易在宽范围内改变孔径大小及其高化学稳定性，例如对高pH值的耐受性。在所有文献中可接受的总的原则是对于大分子使用具有大孔径的介质。在这些孔中的传质是由于扩散过程而不是对流。

在共同待审的SE 0800263-6申请中，描述了一种基于旋转式圆盘技术的方法(Walter和Prewett，Walton，W.H.；Prewett，W.C.(1949)Proc.Phys.Soc.B.62，341-350)来生产具有所选孔隙率的琼脂糖珠来排除大分子。

人源化单克隆抗体(mAb)非常有希望作为生物药物。在纯化mAb中所面临的最大的挑战之一为在细胞培养基中将其与宿主细胞蛋白质(HCP)分离。当今可使用多种mAb分离技术，包括在蛋白质A上的亲和层析法、离子交换层析法和疏水性相互作用层析法(HIC)。所有这些技术涉及使用流动相(吸附缓冲液)，必须调节该流动相以实现mAb-分子与配体之间的相互作用。例如，在HIC中，必须向流动相中加入大量的盐，并且在离子交换层析法的情况下，必须调节流动相的pH，使得与离子交换配体相比，mAb带相反的电荷。此外，当mAb被配体吸附时，必须调节流动相以实现mAb的解吸。

期望得到一种层析介质，该层析介质的孔径分布和表面性能可防止大分子(例如mAb)进入珠，并且在内部可吸附蛋白质和其他肽或生物分子，而与缓冲液条件无关。用于分离生物分子的离子交换剂在低离子强度下能吸附大多数带电荷的生物分子，但是当离子强度提高至超过一定水平时，这些介质失去吸附样品分子的能力。

发明概述

本发明提供了一种介质，该介质在核心实体中具有高疏水性，使得在非常低离子强度和非常高离子强度下、在宽pH范围内，蛋白质均可相互作用或被吸附。

第一方面，本发明涉及一种分离介质，所述分离介质包含多孔性疏水性核心实体；和覆盖所述核心实体的整个外部的多孔性亲水性盖，其中所述盖仅允许低于一定尺寸的分子渗透分离介质的核心实体的内部并与之相互作用。

在一个优选的实施方案中，还优选所述疏水性核心实体仅允许低于一定尺寸的分子渗透分离介质的核心实体的内部并与之相互作用。

所述多孔性亲水性盖为围绕所述核心实体的多孔性外层或夹套/壳。

所述分离介质优选提供有高度疏水性核心，以便结合蛋白质和其他疏水性分子，而与样品的特性和运行条件无关，运行条件例如在层析法的情况下，为离子强度和pH，或者在分批法的情况下为上清液。所述分离介质优选为珠形状，但是也可为膜。