[发明专利]含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因的核酸

说明书

技术领域

本发明涉及含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因的核酸、JFH-1株与JFH-1株以外的株(优选属于基因型1a、1b或2a的株)的嵌合丙型肝炎病毒颗粒、用于生产该病毒颗粒的载体、以及生产该病毒颗粒的细胞。

本发明还涉及使用该病毒颗粒来筛选抗HCV药的方法、将该病毒颗粒灭活或减毒而得到的疫苗、以及将该病毒颗粒作为抗原识别的抗丙型肝炎病毒抗体。

背景技术

丙型肝炎病毒(以下简称为“HCV”)于1989年由Choo等人发现并鉴定为非甲型非乙型肝炎的病因病毒(非专利文献1)。HCV感染是继慢性肝炎后仍持续感染并向肝硬化、肝癌转变的主要病因，据报道，全球有约1亿7千万HCV感染者，日本就存在约200万HCV感染者。HCV的主要感染途径是血液感染，自从可以进行输血用血液的筛选后，虽说我国新的感染者锐减，但认为仍存在许多病毒携带者。

目前的疗法主要是给予PEG化干扰素、或者将PEG化干扰素与抗病毒药利巴韦林结合使用。迄今为止，人们将HCV分为6个基因型，在日本主要是基因型1b和2a。特别是关于基因型1b，其现实状况是：即使给予干扰素和利巴韦林，也无法从体内完全除去病毒，治疗效果也不充分。鉴于上述情况，人们希望开发以预防发病或排除病毒为目的的新型抗病毒药或疫苗。

进行HCV治疗药的开发时，除黑猩猩外，再无反映病毒感染的有效动物，也不存在有效的体外病毒培养系统，这都成为阻碍。近年来，人们开发了可以评价HCV-RNA的复制的HCV复制子(非专利文献2)，其作为与抑制病毒复制有关的HCV抑制剂的筛选系统取得了重大的进步。

HCV是基因组全长约9.6kb的正链的单链RNA病毒，翻译后经蛋白酶的剪切，具有编码作为10种病毒蛋白(核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的前体蛋白的基因。复制子系统是将HCV的结构蛋白的翻译区重组到耐药性基因中，再在其下游插入EMCV(脑心肌炎病毒)的IRES而得到的系统，在导入有该重组RNA的细胞内确认到RNA复制。但是，即使将含有HCV的结构蛋白的全长基因组RNA导入细胞中，也没有确认到病毒颗粒释放到培养液中(非专利文献3)。

近年来，由Wakita等人发现了从重症肝炎患者中分离的、属于基因型2a的HCV株JFH1，明确了其以感染性病毒颗粒的形式被释放到Huh-7细胞(肝癌细胞株)培养液中(专利文献1、非专利文献4)。该感染性HCV颗粒的体外培养系统被期待着在抗HCV药开发中能够成为有用的筛选工具、同时在HCV疫苗的制作中也能成为有效的方法，进行了在体外培养系统中产生HCV颗粒的研究，判明可以产生病毒颗粒的HCV基因组是JFH-1株与JFH-1株以外的HCV的嵌合HCV。该嵌合HCV可以通过将JFH-1基因组的结构基因、即核心、E1、E2和p7蛋白编码部分与其他HCV株的结构基因重组来制作。

作为JFH-1株以外的HCV株与JFH-1株的嵌合HCV，已知有：J6CF株(基因型2a)与JFH-1株的嵌合HCV(非专利文献5)、H77株(基因型1a)与JFH-1株的嵌合HCV(专利文献2、非专利文献6)、以及S52株(基因型3a)与JFH-1株的嵌合HCV(非专利文献7)。

非专利文献8中显示：包含J6CF的结构基因和JFH-1的非结构基因的嵌合HCV的病毒产量最高，而作为基因型1b的Con1株与JFH-1株的嵌合HCV的感染性HCV颗粒的产量为1/10以下。作为其他基因型1b株与JFH-1株的嵌合HCV，专利文献3中记载着：制作将编码TH株的结构蛋白的区与JFH-1基因组重组、并在其编码基因上游插入耐药性基因的基因组(全长基因组复制子RNA)，将其导入Huh-7细胞中后获得耐药性株，从而在其培养上清中产生感染性HCV颗粒，但没有阐明其生产性。

鉴于上述状况，人们需要开发可以使对现有疗法的见效性差、而且具有患者人数多的基因型1b结构的感染性HCV颗粒高产、并且可以在持续感染系统中培养的HCV颗粒生产法。

专利文献1：国际公开WO05080575A1

专利文献2：国际公开WO06096459A2

专利文献3：国际公开WO06022422A1

非专利文献1：Choo，QL等人，Science，244：359-362，1989

非专利文献2：Lohmann，V.等人，Science.，285：110-113，1999

非专利文献3：Pietschmann，T.等人，J.Virol.，76：4008-4021，2002