[发明专利]用含有三链形成单体单元的引物进行的靶扩增和测序

权利要求书

1.一种长度在5到60nt之间的寡核苷酸，其包含式Z的TINA单体，其中所述TINA单体位于距离所述寡核苷酸的3’末端至少1个单体的位置上，并且其中Z表示为如下通用结构：

X-L-I₁-C-I₂

其中X为可掺入寡核苷酸或寡核苷酸类似物或者PNA或PNA类似物的骨架中的骨架单体单元；L为接头；I₁为包含至少一个基本为平面共轭体系的第一嵌入剂，所述体系能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆叠；C为任选的连接部分；I₂为包含至少一个基本为平面共轭体系的第二嵌入剂，所述体系能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆叠。

2.权利要求1的寡核苷酸，其中Z可表示为下式：

-其中R选自芳乙炔基基团。

3.前述权利要求任一项的寡核苷酸，包含选自2、3、4、5、6和7个的多个TINA单体，其中所述TINA单体位于距离所述寡核苷酸的3’末端至少1个单体的位置上。

4.前述权利要求任一项的寡核苷酸，还包括选自DNA单元、RNA单元、LNA单元和2′-OH-修饰单元的修饰的核苷酸单体单元。

5.前述权利要求任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3’末端包含一段3个脱氧核苷酸的连续片段。

6.前述权利要求任一项的寡核苷酸，其中所述TINA单体单元位于距离所述寡核苷酸的5’末端不超过3个单体的位置上。

7.前述权利要求任一项的寡核苷酸，还包含限制性酶切位点。

8.前述权利要求任一项的寡核苷酸，还包含一种选自如下的荧光团：FAM^TM、TET^TM、JOE^TM、VIC^TM、绿；6FAM、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、荧光素、Cy3、Cy5、Cy5.5、得克萨斯红、若丹明、若丹明绿、若丹明红、6-羧基若丹明6G、俄勒冈绿488、Alexa Fluor、俄勒冈绿500或俄勒冈绿514。

9.权利要求8的寡核苷酸，还包含一种选自如下的淬灭染料：TAMRA^TM；Black Hole Quencher^TM、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、DDQ I、DDQ II和Eclipse Dark Quencher。

10.前述权利要求任一项的寡核苷酸，其含有内部间隔基例如C18间隔基、PEG间隔基、C9间隔基、C7间隔基、C6间隔基、环己烷间隔基、环辛烷间隔基、环氧乙烷间隔基或它们的任何组合，并且所述间隔基位于距离所述寡核苷酸的5’末端至少3个核苷酸并距离所述寡核苷酸的3’末端至少3个核苷酸的位置上。

11.一种方法，包括如下步骤：

a.提供模板核酸

b.提供一种第一引物

c.提供聚合酶

d.提供核苷三磷酸

e.混合步骤a-d的组分并提供使所述引物可与所述模板退火的条件。

12.权利要求11的方法，还包括：

f.在可使引物延伸的条件下，延伸与所述模板退火的第一引物。

13.权利要求11或12的方法，其中所述第一种引物为权利要求1-10任一项中所述的寡核苷酸。

14.权利要求11-13任一项的方法，其中所述引物或核苷三磷酸为荧光标记的。

15.权利要求11-14任一项的方法，其中所述核苷三磷酸的一部分为双脱氧核苷三磷酸。

16.权利要求11-15任一项的方法，还包括如下步骤：

g.提供一种第二引物，其与步骤f的第一延伸产物互补

h.使步骤f的产物变性

i.在可使引物延伸的条件下，延伸与所述第一延伸产物退火的第二引物。

17.权利要求16的方法，其中所述第二引物为权利要求1-10任一项中所述的寡核苷酸。

18.权利要求17的方法，包括将变性、退火和延伸重复进行至少10次。