[发明专利]hERG突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及人ether-à-go-go相关基因(hERG)的突变体，及其用于筛选结 合hERG蛋白的潜在药物的应用。

背景技术

人ether-à-go-go相关基因(hERG)编码传导心脏中的快速型延迟整流钾电 流(I_Kr)的离子通道的成孔亚基。hERG中的功能获得性突变和缺失性突变可分 别导致短QT综合征和长QT综合征的临床病症，这表明了hERG在维持心 脏电稳定性中的关键作用。先天性LQTS并不常见，并且可能由10个不同基 因的突变导致，这些基因大部分编码离子通道或其调节亚基。由药物诱导的 hERG阻断而产生的获得性LQTS更为常见，并且是药物退出医药市场的最 常见原因。因此，现已要求对药物的hERG亲和力进行早期评估，并且需要 详细理解药物如何与hERG结合。

已很好地建立药物结合在hERG孔区的中央腔中，并且在此结合发生之 前需要通道开放。在去极化电位下，hERG通道可以以开放或失活的状态存 在，然而尚未建立开放状态还是失活状态是优选的药物结合状态。支持状态 依赖性药物结合的证据主要来自于显示对消除失活(S620T；G628C+S631C) 或减少失活(S631A)的突变通道的亲和力降低的研究。然而，这些突变体的位 置接近于选择性过滤器(selectivity filter)和推定的药物结合袋(drug-binding  pocket)(参见图1)，并且可由此通过药物结合袋中的局部变化直接或间接地 影响药物阻断。为了解决这个问题，本发明人研究了对远离影响失活的中央 孔的残基进行突变是否以类似于所报道的S631A和S620T突变体的方式影响 药物与hERG的结合。

本发明人现已制备了可用于筛选药物对hERG亲和力的新hERG突变体。

发明内容

第一方面，本发明提供了能够表达人ether-à-go-go相关基因(hERG)突变 体的分离的核酸分子，该突变体增强hERG失活，其中所述突变不位于hERG 蛋白离子转导孔腔内的药物结合袋附近。

优选所述突变位于S5P连接子的α-螺旋上。更优选所述突变是N588E、 H587K、G584S或Q592D。然而，应理解，不位于hERG蛋白的药物结合袋中 但仍增强失活的其他突变也适合于本发明。

本发明人已经将位于远离药物结合袋的S5P连接子的α-螺旋上的残基 N588、H587、G584和Q592突变为谷氨酸(N588E)、赖氨酸(N587K)、丝氨 酸(G584S)或天门冬氨酸(Q592D)。在细胞中表达时，这些突变影响hERG蛋 白活性的失活。其他候选区域包括不是药物结合袋一部分的所有区域。这包 括外孔螺旋(例如F557A)、电压感受域(例如A527V)、N末端和C-末端的胞 质域，以及连接跨膜螺旋片段的细胞内和细胞外连接子。

优选所述分离的核酸分子编码包含基本如图12(SEQ ID NO：1)中所示的 一个或多个突变的hERG突变体。

所述核酸分子可包含促进离子通道活化的一个或多个其他突变，例如 L524W、L532P、V535A、A536V、K538Q。

第二方面，本发明提供了表达本发明第一方面所述的分离的核酸分子的 载体。

优选所述载体包含适合在哺乳动物细胞表达，优选高水平表达的启动子 和有助于选择表达hERG通道的细胞的抗生素抗性基因。

第三方面，本发明提供了表达本发明第一方面所述的分离的核酸分子或 本发明第二方面所述的载体的稳定细胞系。所述稳定细胞系表达hERG突变蛋 白。

优选所述细胞选自，但不限于中国仓鼠卵巢细胞，人胚肾细胞或转化的 非洲绿猴肾成纤维细胞。

可使用包括抗生素选择然后进行克隆扩增的本领域已知技术来制备稳定 细胞系。

所述细胞系特别适合用于筛选结合hERG蛋白的潜在药物。

第四方面，本发明提供了用于筛选结合hERG蛋白的潜在药物的测定系统 (assay)(测定法或测定装置)，其包括：

本发明第三方面所述的稳定细胞系；和

用于测定细胞中hERG蛋白活性的工具(means)。