[发明专利]DNA甲基化测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及对生物来源标本所含的基因组DNA中目标DNA区域中的被甲基化了的DNA含量进行测定的方法。

背景技术

作为用于评价生物来源标本所含基因组DNA中目标DNA区域中的DNA的甲基化状态的方法，例如，有测定在基因组DNA中目标DNA区域中的被甲基化了的DNA的含量的方法(例如，参照Nucleic Acids Res.1994 Aug 11；22(15)：2990-7、和Proc Natl Acad Sci U S A.1997 Mar 18；94(6)：2284-9)。在该测定方法中，首先需要从基因组DNA来源的DNA试样中提取含有目标DNA区域的DNA，提取操作十分繁杂。

另外，作为测定被提取的DNA的目标区域中的被甲基化了的DNA含量的方法，已知有以下的方法，例如(1)使用亚硫酸盐等修饰该DNA之后，将其供于DNA聚合酶引起的DNA合成的链反应(Polymerase Chain Reaction(聚合酶链反应)；以下有时记为PCR)，从而将目标区域扩增的方法；(2)使用甲基化敏感性限制酶将该DNA消化后，将其供于PCR，从而使目标区域扩增的方法。这些方法的任一种中，用于甲基化的检测的DNA的修饰以及其后的生成物的精制、用于PCR的反应系的制备、DNA扩增的确认等中均需要耗时。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种简便测定生物来源标本所含的基因组DNA中目标DNA区域中的被甲基化了的DNA含量的方法。

即，本发明提供以下方案。

[发明1]

一种测定方法，其是对生物来源标本所含基因组DNA中目标DNA区域中的被甲基化了的DNA含量进行测定的方法，具有以下工序：

(1)第一工序，其中，对生物来源标本所含基因组DNA来源的DNA试样，进行利用甲基化敏感性限制酶的消化处理，

(2)第二工序，其中，从由第一工序获得的经消化处理了的DNA试样获取含有目标DNA区域的单链DNA(正链)，使该单链DNA(正链)与单链固定化寡核苷酸碱基配对，从而选择上述单链DNA，上述单链固定化寡核苷酸具有对该单链DNA的3’末端的一部分(不含上述目标DNA区域)有互补性的碱基序列，

(3)第三工序，其中，将由第二工序选择的单链DNA作为模板，将上述单链固定化寡核苷酸作为引物，使该引物1次延伸，从而使上述单链DNA延伸形成双链DNA，以及，

(4)第四工序，其中，作为下述各本步骤的前步骤，具有将由第三工序获得的延伸形成的双链DNA暂时分离成单链状态的步骤(前步骤)，并且，作为本步骤，具有第A步骤(本步骤)和第B步骤(本步骤)，

(a)第A步骤，其具有：通过使生成的为单链状态的DNA(正链)与上述单链固定化寡核苷酸(负链)碱基配对，从而选择上述为单链状态的DNA的第A1步骤；和将在第A1步骤选择的为单链状态的DNA为模板，将上述单链固定化寡核苷酸作为引物，通过使该引物1次延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA的第A2步骤，

(b)第B步骤，其中，将生成的为单链状态的DNA(负链)作为模板，将具有下述碱基序列(正链)的引物(反向引物)作为延伸引物，使该延伸引物1次延伸，从而使上述为单链状态的DNA延伸形成双链DNA，所述碱基序列(正链)是对上述为单链状态的DNA(负链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)具有互补性的碱基序列(正链)，上述为单链状态的DNA(负链)所具有的碱基序列的部分碱基序列(负链)与对上述目标DNA区域的碱基序列(正链)有互补性的碱基序列(负链)的3’末端相比更靠近3’末端侧，

进而，将由上述各本步骤获得的延伸形成了的双链DNA暂时分离成单链状态后，进行反复操作，从而将上述目标DNA区域中的被甲基化了的DNA扩增到可以检测的量，将扩增了的DNA的量定量。

[发明2]

根据发明1所述的方法，其中，在第二工序中使含有目标DNA区域的单链DNA(正链)与具有对该单链DNA的3’末端的一部分(不含上述目标DNA区域)有互补性的碱基序列的单链固定化寡核苷酸碱基配对时，在含有二价阳离子的反应系中使碱基配对。

[发明3]

根据发明2所述的方法，其中，二价阳离子为镁离子。

[发明4]

一种测定方法，其中，在第四工序的前步骤之前，