[发明专利]鞭毛蛋白多肽疫苗

说明书

通过EFS-WEB提交的序列表的引用

按照专利审查程序手册(MPEP)§1730II.B.2(a)(C)批准说明，通过美国专利商标局(USPTO)EFS-WEB服务器电子提交的以下序列表全部内容通过引用全文纳入本文以用于所有目的。序列表根据电子提交文本文件鉴定如下：

技术领域

本发明涉及提供鞭毛蛋白多肽以便刺激先天免疫应答的疫苗。所述鞭毛蛋白多肽可单独使用或与抗原联用以引发适应性免疫应答。

背景技术

鞭毛蛋白是约500个氨基酸的单体蛋白质，其聚合形成与细菌运动相关的鞭毛。鞭毛是通过类似螺旋桨的旋转赋予细菌运动性的鞭状结构。这些结构是由鞭毛蛋白组成的聚合物，通过基础小体和钩状体结构锚定到细菌细胞壁上。术语“鞭毛蛋白”指聚合形成丝状体的单体亚基，而术语“鞭毛”更常指丝状体、基础小体或钩状体的任何组分。

鞭毛基因表达受到严格调控，钩状体和基础小体(HBB)基因首先表达，最终的鞭毛组分仅在HBB装配完全时才表达。鞭毛基因分为三种转录类型。I类基因包括主转录调控蛋白FlhC/FlhD。II类基因编码基础小体和钩状体，还包括转录激活蛋白FliA和FliA的阻抑蛋白FlgM。HBB完成后，阻抑蛋白FlgM经HBB被输出。这会消耗FlgM蛋白的细菌胞质溶胶，由此释放FliA，其与III类基因启动子结合，激活III类基因的转录。III类基因编码钩状体-丝状体衔接头、帽、发动蛋白、化感系统和聚合形成鞭毛丝状体的鞭毛蛋白。

通过位于HBB中的III型分泌系统(T3SS)输出鞭毛蛋白，该分泌系统与转运毒力因子的其它T3SS在进化上相关。该分泌机构形成跨越内膜、壁膜间隙和外膜的单一结构，终止于细菌细胞壁外表面的钩状体结构。鞭毛蛋白经HBB的中空核心被输出，最多30,000个鞭毛蛋白亚基在钩状体末端进行装配。

来自各类细菌的鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：23所示。编码所列鞭毛蛋白多肽的核苷酸序列还在NCBI GenBank数据库中公开可得。其中，已知来自鼠伤寒沙门氏菌I(S.Typhimurium 1)、幽门螺杆菌(H.Pylori)、霍乱弧菌(V.Cholera)、粘质沙雷氏菌(S.marcesens)、福氏痢疾杆菌(S.flexneri)、梅毒螺旋体(T.Pallidum)、嗜肺军团菌(L.pneumophila)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferei)、艰难梭状芽孢杆菌(C.difficile)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)、根癌农杆菌(A.tumefaciens)、羽扇豆根瘤菌(R.lupini)、卡氏巴尔通体(B.clarridgeiae)、奇异变形杆菌(P.Mirabilis)、枯草杆菌(B.subtilus)、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和大肠杆菌(E.coli)的鞭毛蛋白序列。

鞭毛蛋白单体的形状类似大写的希腊字母γ(Γ)，由结构域D0穿过D3形成。形成主干的D0和D1由串联的长α螺旋组成，在不同的细菌中高度保守。在单体发生层叠时，D0和D1埋于丝状体中心。Γ的顶部由D2和D3组成，这是两个高度可变的球状结构域，暴露在鞭毛丝状体的表面上，是抗体应答指向的结构域。然而，D2和D3结构域不参与引发先天免疫应答。

先天免疫应答分别由细胞表面的toll样受体(TLR)、细胞内的Nod-LRR蛋白(NLR)以及D1和D0区域介导。先天免疫应答包括对TLR(包括TLR5)激活作用起反应而生成细胞因子，以及对某些NLR(包括Ipaf)起反应而激活胱冬酶-1的和分泌IL-1β。该应答不依赖特异性抗原，但可作为抗原特异性适应性免疫应答的佐剂发挥作用。所述抗原可以疫苗或感染的形式由外部提供，或可来自本身，例如肿瘤相关抗原的情况。

2002年10月31日公开的PCT公布WO02/085933证明，鞭毛多肽能够通过与toll样受体5(TLR5)的相互作用刺激先天免疫应答。该受体展示于细胞表面上，与鞭毛蛋白多肽在胞外发生相互作用。2005年7月7日公开的美国专利公布2005/0147627注意到负责与TLR5相互作用的鞭毛蛋白区域仅发现于D1结构域。Smith，K.D.等，Nature Immunol.(2003)4：1247-1253公开了TLR5识别鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白上的一个位点，其由N末端残基78-129和135-173以及C末端残基395-444组成。