[发明专利]纯化促红细胞生成素的方法

说明书

本发明涉及纯化促红细胞生成素的方法，其中将产生促红细胞生成素的真核细胞的包含促红细胞生成素的培养上清以特定方式连续进行特定的色谱纯化步骤。

促红细胞生成素，简称EPO，是刺激骨髓中红细胞形成的糖蛋白。EPO主要在肾中形成，从此处借助血液循环到达其靶。在肾机能不全的情况下，受损的肾产生不足的EPO或者根本不产生EPO，这导致骨髓干细胞几乎不产生红细胞。这种所谓的肾性贫血可以通过施用生理量的EPO来治疗，该EPO刺激骨髓中红细胞的形成。用于施用的EPO可以从人尿中获得或者通过基因工程方法产生。由于EPO仅在人体中痕量产生，所以从天然来源分离EPO作为治疗应用实际上不可能。因此，基因工程方法是大量产生该物质的仅有的经济选择。

自从1984年鉴定了人促红细胞生成素基因，促红细胞生成素的重组生产已经成为可能。从二十世纪九十年代初开始，已经开发了各种含有人促红细胞生成素的药物，该人促红细胞生成素通过基因工程路线在真核细胞，主要在CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)中产生。重组人促红细胞生成素的生产在例如EP-A-0148605和EP-A-205564中有描述。

促红细胞生成素的重组生产通常在CHO宿主细胞中完成。尽管这些宿主细胞曾经在加入胎牛血清并且有时也加入牛胰岛素的培养基中生长，但是目前它们通常在无血清和无蛋白培养基中生长。这种方式能够完全避免牛蛋白、牛病毒、牛DNA或者其他不期望的牛源物质污染的风险。用于生长真核细胞的合适无血清和无蛋白培养基可由各种生产商提供，例如MAM-PF2培养基，其例如由Bioconcept，Allschwil，Switzerland出售；或者DMEM和DMENU12培养基，其由例如Invitrogen/Gibco，Eggenstein，Germany出售。

各种促红细胞生成素的色谱纯化方法在现有技术中也有描述。EP-A-0228452描述了从液体中纯化生物活性促红细胞生成素的方法，该方法包括阴离子交换色谱和反相色谱的色谱步骤。

EP-A-0267678描述了无血清培养基中产生的促红细胞生成素的纯化，其通过连续进行的渗析，离子交换色谱，制备型反相HPLC和凝胶过滤色谱进行。此处，凝胶过滤色谱步骤能够由离子交换色谱替代。同样地，提出于(第一)离子交换色谱前在Blue trisacryl柱上进行染料亲和色谱。

EP-A-0830376描述了纯化促红细胞生成素的方法，其中将来自培养上清的EPO在色谱纯化的第一步中进行染料亲和色谱。然后在第二步中，进行疏水载体上的色谱，之后进行羟基磷灰石色谱。然后进行反相HPLC，其后进行最后的色谱步骤阴离子交换色谱。

EP-A-1127063描述了包括以下步骤的促红细胞生成素纯化方法：示差沉淀，疏水相互作用色谱，渗滤，阴离子交换色谱，阳离子交换色谱和尺寸排阻色谱。每个纯化步骤以EP-A-1127063中提到的顺序进行。在该方法的一个变体中，纯化包括如下步骤：示差沉淀，疏水相互作用色谱，渗滤，阴离子交换色谱，阳离子交换色谱，进一步的渗滤和尺寸排阻色谱。在每种情况下，该方法在第一步中进行沉淀，之后进行离心。同样地，强制进行凝胶过滤以完成色谱纯化。

国际申请WO-A-03/045996描述了EPO的纯化方法，该方法包括阴离子交换色谱和其后的反相色谱以及进一步阴离子交换色谱。第二阴离子交换色谱之后是利用凝胶过滤介质的尺寸排阻色谱。

促红细胞生成素的纯化也是EP-A-0428267的主题。此处，色谱在Q琼脂糖(Q Sepharose)柱上进行，在某些情况下，随后进行反相色谱和凝胶过滤。

WO2005/121173提供了纯化通过发酵方法产生的EPO的方法。该方法基于至少4种不同色谱分离方法的色谱纯化。第一阴离子交换色谱之后是亲和色谱、疏水相互作用色谱和羟基磷灰石色谱，这3个最后提及的色谱类型的顺序是按需要进行的。最后，再次使用阴离子交换色谱。

因此，当使用这些方法来生产满足欧洲药典规定的纯度标准的EPO时，需要至少5个色谱步骤。合适的EPO标准例如小于100ppm的来源于宿主细胞的异源蛋白含量，小于100pg/mg EPO的来自宿主细胞的DNA含量，以及最后满足关于同种型组成标准的组成(Ph.Eur.；01/2002：1316)。