[发明专利]通过修饰的转运蛋白表达而最小化氨基甲酸乙酯产生的功能增强的酵母

说明书

背景技术

氨基甲酸乙酯(也称为尿烷)作为来源于用酵母发酵食物和饮料的直接副产物形成。例如，氨基甲酸乙酯(可能的致癌剂)的形成通过尿素与乙醇的反应而存在于发酵葡萄汁(grape must)(葡萄酒(wine))中。

可以用通过DUR1，2的组成型表达降解尿素的酵母菌株来产生具有低氨基甲酸乙酯浓度的发酵饮料或食品(Coulon等，2006，Am.J.Enol.Vitic.：113-124)。

在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，DUR3基因编码在某些条件下主动转运尿素至酵母细胞内的尿素转运蛋白(DUR3p)。DUR3基因的转录正常情况下受到氮分解代谢物阻抑(NCR，ElBerry等，1993，J.Bacteriol.175：4688-4698；Goffeau等，1996，Science 274(5287)，546-547；Johnston等，1994，Science 265(5181)，2077-2082)。这只是利用糖类的酵母细胞中涉及氮代谢的合成代谢酶和分解代谢酶的调节网络的一个方面。

概述

本发明部分涉及提供用于降低发酵饮料或食品中氨基甲酸乙酯浓度的产品和方法，其使用已转化来在发酵条件下表达尿素转运蛋白如DUR3以主动转运尿素至酵母细胞内的酵母菌株。还可以修饰酵母以在发酵条件下表达胞内尿素降解酶活性，如DUR1，2。

本发明部分提供已转化以在发酵条件下例如组成型表达DUR3的新的酵母菌株，以及用于酵母菌株的功能增强以使该酵母在发酵条件下例如组成型表达酵母DUR3的方法，以及该酵母菌株在降低发酵饮料或食品氨基甲酸乙酯中的用途。

在本发明的另一实施方案中，提供已转化以组成型表达DUR1，2和DUR3的新的酵母菌株，以及该酵母菌株在降低发酵饮料或食品氨基甲酸乙酯中的用途。

在本发明的另一实施方案中，提供转化以不断表达DUR3p的酵母菌株和转化以不断表达DUR3p和尿素酰胺裂合酶(amidolyase)二者的酵母菌株，该尿素酰胺裂合酶包含尿素羧化酶(urea carboxylase)和脲基甲酸酯水解酶活性二者。

在本发明的另一实施方案中，提供已转化以在发酵条件下持续摄取尿素的酵母菌株。其中该酵母可以组成型表达DUR3。

在本发明的另一实施方案中，提供已转化以在发酵条件下持续摄取并同时降解尿素的酵母菌株。其中该酵母菌株可以组成型表达DUR1，2和DUR3二者。

在本发明的另一实施方案中，提供用于修饰酵母菌株的方法，其包括转化该酵母菌株以在发酵条件下降低尿素转运蛋白表达的氮分解代谢物阻抑。其中该尿素转运蛋白可以由DUR3编码，且其中该尿素转运蛋白可以是DUR3p。

在本发明的另一实施方案中，提供用于修饰酵母菌株以组成型表达DUR3的方法。其中该方法可以包括将1/2TRP1-PGK_p-D UR3-PGK_t-kanMX-1/2TRP1盒整合入TRP1基因座。其中该方法可以包括用包含编码DUR3p的编码序列的新的核酸转化该酵母菌株。其中该方法可以包括用包含不受氮分解代谢物阻抑的启动子的重组核酸转化该酵母。

在本发明的另一实施方案中，提供通过上文该功能增强的酵母菌株，如在发酵条件下例如通过组成型表达来表达DUR3或DUR1，2和DUR3二者的菌株的用途来产生发酵饮料或食品的方法。

在本发明的另一实施方案中，提供组成型表达DUR3或DUR1，2和DUR3二者的转化的酵母菌株以降低发酵饮料或食品中氨基甲酸乙酯的浓度的用途。其中该发酵饮料或食品可以是葡萄酒，且降低的氨基甲酸乙酯的浓度可以是30ppb以下。

在本发明的另一实施方案中，提供用组成型表达DUR3或DUR1，2和DUR3二者的转化的酵母菌株产生的具有降低的氨基甲酸乙酯浓度的发酵饮料或食品。其中该发酵饮料或食品可以是葡萄酒，且降低的氨基甲酸乙酯的浓度可以是30ppb以下。

附图简述

图1.DUR3遗传盒。

图2显示酿酒酵母DUR3p蛋白质序列(SEQ ID NO：7)。

图3显示酿酒酵母DUR3编码序列(SEQ ID NO：8)。

图4显示在DUR1，2起始密码子ATG处终止的DUR1，2基因上游区域的部分序列(SEQ ID NO：9)。突出显示两个推定的NCR元件GATAA(G)框(一个在位点-54至-58，另一个在位点-320至-324)以及推定的TATAA框。