[发明专利]具有改进的D-木糖利用能力的棒状杆菌转化体有效
申请号: | 200980123139.2 | 申请日: | 2009-06-10 |
公开(公告)号: | CN102066553A | 公开(公告)日: | 2011-05-18 |
发明(设计)人: | 汤川英明;乾将行 | 申请(专利权)人: | 财团法人地球环境产业技术研究机构 |
主分类号: | C12N1/21 | 分类号: | C12N1/21;C12P13/04;C12N15/09;C12P7/06;C12P7/18;C12P7/46;C12P7/54;C12P7/56 |
代理公司: | 中原信达知识产权代理有限责任公司 11219 | 代理人: | 张颖;樊卫民 |
地址: | 日本*** | 国省代码: | 日本;JP |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 具有 改进 利用 能力 杆菌 转化 | ||
技术领域
本发明涉及D-木糖利用技术。更详细来说,本发明涉及通过针对改进的D-木糖利用能力进行遗传修饰产生的棒状杆菌转化体,并涉及使用所述转化体的有效的有机化合物生产技术。
背景技术
纤维素生物质用作原材料通过生物方法生产多种有机酸化合物、乙醇等。纤维素生物质的实用性可归因于其可利用性。与糖基生物质例如玉米淀粉和糖不同,纤维素生物质容易以各种不同形式例如农业废弃物或木材废弃物的形式低成本获得,并因此不被认为将对确保食物资源构成障碍。纤维素生物质包含约35到45质量%的纤维素、约30到40质量%的半纤维素、约10质量%的木质素和约10质量%的其他成分。纤维素是葡萄糖(一种己糖)的聚合物。同时,半纤维素主要由戊糖例如木糖和阿拉伯糖构成。
纤维素生物质例如玉米秸秆、麦杆、稻秆和甘蔗渣的半纤维素,主要由D-木糖构成。因此,为了有效利用纤维素生物质,迫切需要建立起通过生物方法有效利用D-木糖的技术。
在纤维素生物质利用技术中,需要首先将原材料糖化成单糖例如己糖和戊糖,并且出于工艺设计的原因,这些单糖共存于培养基中用于生产有机化合物。通常在这种情况下,发生戊糖被己糖的所谓“葡萄糖阻遏(glucose repression)”。葡萄糖阻遏使得不能平行和同时地利用己糖和戊糖,是一种使工艺设计和操作控制复杂化的因素,并阻碍了生物质的工业化和有效利用技术的建立。在这方面的改进也是需要的。
众所周知,许多微生物利用葡萄糖——一种己糖,通过发酵来生产多种有机化合物,也已知道,某些微生物利用D-木糖——一种戊糖来生产乙醇等。
专利文献1和非专利文献1公开了一种技术,其中通过经质粒导入三个基因、即来自于树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因以及来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的木酮糖激酶基因,为不能利用D-木糖的野生型酿酒酵母提供了D-木糖利用能力;并公开了使用所获得的酿酒酵母转化体的D-木糖利用技术[0]。但是酿酒酵母转化体不具有足够的D-木糖利用速率,并且在存在D-葡萄糖和D-木糖二者的情况下,观察到了D-木糖利用中的葡萄糖阻遏(在存在D-葡萄糖的情况下,D-木糖利用速率极大减慢)。换句话说,还没有建立有效的D-木糖利用技术。因此,需要在这些方面进行改进。
非专利文献2也涉及包含酿酒酵母的技术,公开了一种用于分离具有改进的D-木糖摄取和同化速率的变体的技术,通过产生具有被破坏的醛糖还原酶基因并高度表达来自酿酒酵母的木酮糖激酶基因、核酮糖5-磷酸异构酶基因、核酮糖5-磷酸差向异构酶基因、转酮酶基因和转醛酶基因以及来自真菌Piromyces sp.的木糖异构酶基因的酿酒酵母转化体获得了变体,然后在厌氧限木糖恒化器中并随后在厌氧自动顺序分批反应器中进行培养,并公开了使用所获得的菌株的D-木糖利用技术。在该技术中,与上述专利文献1和非专利文献1的技术中相比,D-木糖利用速率增加,但仍然不够。此外,在存在D-葡萄糖和D-木糖二者的情况下,仍然观察到了D-木糖利用中的葡萄糖阻遏。因此,需要在这些方面进行改进。
专利文献2公开了D-木糖利用技术,其中利用了通过将四个基因、即来自大肠杆菌的木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因、转酮酶基因和转醛酶基因经质粒导入不能利用D-木糖的野生型运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)中并使基因表达所获得的运动发酵单胞菌转化体。
专利文献3公开了D-木糖利用技术,其中利用了通过将四个基因、即来自大肠杆菌的木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因、转酮酶基因和转醛酶基因整合到野生型运动发酵单胞菌的染色体中并使基因表达所类似获得的运动发酵单胞菌转化体,转化体中的四个基因更加稳定。在这些已知技术中,在一定程度上实现了己糖和戊糖的同时利用,但是D-木糖的消耗速率(利用速率)与D-葡萄糖的消耗速率(利用速率)相比不足,因此需要进一步改进以建立同时利用己糖和戊糖的实用技术。
尽管野生型大肠杆菌菌株能够例如戊糖包括D-木糖,但已知在D-葡萄糖和D-木糖同时存在的情况下,上面提到的葡萄糖阻遏影响了D-木糖利用。非专利文献3和非专利文献4报道了通过破坏负责葡萄糖摄入的ptsG(葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白)基因,可以获得能够同时利用D-葡萄糖和D-木糖的微生物。但是,大肠杆菌具有对工艺操作条件的变化敏感而产生溶解的问题。此外,大肠杆菌的乙醇耐受性比酿酒酵母和运动发酵单胞菌的乙醇耐受性低。因此,利用大肠杆菌生产乙醇具有乙醇终浓度低的问题(从发酵液浓缩和纯化乙醇需要大量能量)。
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