[发明专利]同种型特异性的胰岛素类似物

说明书

本发明系在National Institutes of Health提供的合作协议下由政府资助完成，合同号NIH R01DK069764、R01-DK74176、以及R01-DK065890。美国政府可能对本发明拥有某些权益。

发明背景

施用胰岛素早已确定为糖尿病的治疗方法。胰岛素是单链前体胰岛素原的产物，其中连接区域(35个残基)连接B链的C端残基(残基B30)与A链的N端残基(图1A)。虽然胰岛素原的结构尚未确定，但是多种迹象表明其由类似胰岛素的核心与无序的连接肽组成(图1B)。三个特定二硫键(A6-A11，A7-B7，和A20-B19；图1B)的形成据信与粗面内质网(ER)中胰岛素原的氧化折叠相关。胰岛素原从ER输出到高尔基体后不久即组装以形成可溶的Zn²⁺协调的六聚体。内部蛋白水解消化以及转化为胰岛素发生于未成熟的分泌颗粒，然后是形态凝聚。通过电子显微术(EM)已观察到成熟存储颗粒中的锌胰岛素六聚体的结晶阵列。因此天然寡聚体的组装与分解是胰岛素生物合成、存储、分泌、以及功能路径所固有的。

已广泛研究了胰岛素A和/或B链中氨基酸置换对皮下注射后胰岛素功能的药代动力学的可能有利影响。本领域已知加速或减缓吸收时间过程的置换例子。此类置换(例如中的Asp^B28和中的[Lys^B28，Pro^B29])可以并经常与更快的纤维化和更差的物理稳定性相关。实际上，一系列10种人胰岛素类似物已试验了纤维化易感性，包括Asp^B28-胰岛素和Asp^B10-胰岛素。发现所有10种在pH 7.4和37℃比人胰岛素对更易于纤维化。所述10种置换位于胰岛素分子的不同位点，并可能与经典热力学稳定性的多种改变相关。这些结果提示在药学条件下保护胰岛素类似物免于纤维化的置换很少；对其设计没有明显的结构标准或规则。目前的蛋白纤维化理论认为纤维化机制通过部分折叠的中间状态进行，然后依次聚集形成淀粉样核。在该理论中，有可能稳定天然状态的氨基酸置换可能或不能稳定所述部分折叠的中间状态，并且可能或不能升高(或降低)天然状态与中间状态之间的自由能障碍。因此，现有理论指出胰岛素分子中某一给定氨基酸置换升高或降低纤维化风险的倾向是高度不可预测的。

已知蛋白质例如胰岛素的修饰增加对纤维化的抗性但是削弱生物学活性。例如，“微型胰岛素原”用于描述多种胰岛素原类似物，其包含缩短的连接区域，例如胰岛素A和B链之间的二肽连接物。也可存在其它置换，例如猪胰岛素中发现的Ala^B30代替人胰岛素中发现的Thr^B30。该类似物有时系指猪胰岛素前体，或称PIP。微型胰岛素原类似物通常抗纤维化但是削弱其活性。通常，长度＜4个残基的连接肽以生物学活性为代价阻断胰岛素纤维化；据报道对胰岛素受体的亲和力降低至少10,000倍。虽然此类类似物可用作重组胰岛素生产中的中间产物，但其本身不能用于糖尿病治疗。

胰岛素通过结合并激活称为胰岛素受体的细胞受体介导其生物学功能。胰岛素受体的细胞外部分结合胰岛素，而细胞内部分包含激素可激活的酪氨酸激酶结构域。选择性RNA剪接导致两种截然不同的胰岛素受体(IR)同种型，称为IR-A和IR-B。B同种型包含由胰岛素受体基因的外显子11编码的α亚基中的12个额外氨基酸。A同种型缺少所述12残基片段。本发明涉及优先结合胰岛素受体的一种同种型的胰岛素类似物设计。

对胰岛素受体亲和力过低或过高的胰岛素类似物可能在糖尿病治疗中具有不利的生物学性质。由于胰岛素从血流中的清除主要通过与目标组织胰岛素受体的相互作用调节，预计受体结合活性低于25％可表现出在血流中的存在时间延长。在快速作用的胰岛素类似物与食物摄取协调给予以严格控制糖血症中，所述延缓的清除是不利的。这种降低的亲和力也可降低胰岛素类似物的效力，需要注射更大量的蛋白溶液或使用更高浓度的蛋白溶液。本发明涉及优先结合胰岛素受体的一种同种型的胰岛素类似物设计。

相反，对胰岛素受体亲和力高于野生型胰岛素的胰岛素类似物可于改变的信号传导特性以及改变的激素-受体复合物的细胞加工相关。超活化胰岛素类似物与在目标细胞表面或细胞内囊泡表面的胰岛素受体之间的复合物延长的停留时间可导致增强的有丝分裂信号传导。如果氨基酸置换不仅增强该类似物对胰岛素受体的结合，而且增强对I型IGF受体的结合，则可产生增强的有丝分裂。由于这些原因，需要对胰岛素受体和IGF受体亲和力与野生型人胰岛素相似的类似物。