[发明专利]RNA多磷酸酶组合物、试剂盒及其应用

说明书

本申请要求2008年5月2日提交的美国申请系列号61/050,041的优先权，它通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及本领域以前没有描述的RNA 5′多磷酸酶(polyphosphatase)的发现、发现所述酶的方法、所述酶的组合物、制备所述酶的方法，和将所述酶用于生物医学研究、用于人和非人诊断学、用于治疗产品的生产和用于其它用途的各种方法和试剂盒。具体地，一些实施方案提供了使用RNA多磷酸酶分离、纯化、生产和测定加帽的RNA的组合物、试剂盒和方法，其中使用生物学样品或来自体外加帽反应的样品，其中所述样品也含有未加帽的RNA。其它实施方案提供了组合物、试剂盒和方法，其中RNA多磷酸酶包括用于分析物特异性测定的信号放大酶。

发明背景

RNA分子的5′末端上的化学部分会影响它在细胞或生物体中的结构、稳定性、生化加工、运输、生物学功能和命运。在RNA的5′末端处常见的化学部分包括三磷酸、单磷酸、羟基和帽核苷酸。5′末端处常见的化学部分包括三磷酸、单磷酸、羟基和帽核苷酸。5′末端上的特定化学部分会提供关于RNA的起源、加工、成熟和稳定性的重要线索。在新鉴别的RNA中的该部分的表征，甚至可以提示RNA在细胞中的作用。

例如，细菌mRNA、小的原核和真核核糖体RNA(例如，5S或5.8S rRNA)和转运RNA(tRNA)通常具有5′三磷酸基团。

大核糖体RNA(例如，18S和26S或28S真核rRNA，或16S和23S原核rRNA)和真核或病毒编码的微RNA(miRNA)通常具有5′单磷酸基团。至少一些从前-mRNA剪接反应最初产生的内含子RNA分子也具有5′磷酸基团。

RNA酶A-降解的RNA和一些其它的内切核酸酶裂解处理的RNA分子具有5′羟基。

大多数真核细胞mRNA和大多数真核病毒mRNA在它们的5′端上具有“帽”或“帽核苷酸”(例如，“N⁷-甲基鸟苷”或“m⁷G”帽核苷，其通过它的5′-碳连接到三磷酸基团上，后者又连接到初级mRNA的最5′的核苷酸的5′-碳上)。另外，已经描述了有些不翻译成蛋白的真核RNA，称作“非编码RNA”或“ncRNA”，它们中的一些被加帽。某些加帽的ncRNA像大多数真核mRNA一样也具有3′聚(A)尾序。例如，Rinn，JL等人(Cell 129：1311-1323，2007)描述了在人12号染色体的HOXC区域(称作“HOTAIR”)中编码的一种加帽的且聚腺苷酸化的2.2-千碱基ncRNA，其对2号染色体上的HOXD基因的表达具有深远影响。另外，样品中的某些其它真核RNA(诸如小核RNA(“snRNA”)和前-miRNA)可以被加帽。

真核细胞和病毒mRNA(和某些其它形式的RNA)的5′帽在mRNA代谢中起重要作用，且在不同程度上是细胞核中mRNA转录物的加工和成熟、mRNA从细胞核向细胞质的运输、mRNA稳定性和mRNA向蛋白的有效翻译所需要的。例如，所述帽在蛋白合成的开始和真核mRNA加工以及体内稳定性中起关键作用。所述帽会提供对5′核糖核酸外切酶(XRN)活性的抗性，且它的缺失会导致mRNA的快速降解(例如，参见Mol.Biol.Med.5：1-14，1988；Cell 32：681-694，1983)。因而，为导入(例如，通过显微注射进卵母细胞或转染进细胞)和在真核细胞中表达而制备(例如，在体外)的mRNA应当被加帽。

许多真核病毒RNA仅在被加帽时是感染性的，且当通过转染或显微注射将没有加帽的RNA分子(即，它们是“未加帽的”)导入细胞时，它们会被细胞RNA酶迅速降解(例如，参见Krieg，和Melton，Nucleic Acids Res.12：7057，1984；Drummond，等人Nucleic Acids Res.13：7375，1979)。