[发明专利]改进的基于纤连蛋白的结合分子及其用途

说明书

优先权信息

本申请要求2008年5月2日递交的美国临时专利申请系列号61/050,142的优选权，其内容在此全文并入作为参考。

相关信息

本说明书通篇引述的任何专利、专利申请和参考文献的内容在此全文并入作为参考。

发明背景

能够与期望的靶表位特异性结合的分子作为治疗剂和医学诊断工具均具有极大意义。此类分子的公知实例是单克隆抗体。对于几乎任何结构表位，都可以选择出特异性地并以高亲和力与之结合的抗体。所以，抗体常规地用作为研究工具和FDA批准的治疗剂，从而治疗性和诊断性单克隆抗体的全球市场目前价值约$300亿。

然而，单克隆抗体具有许多缺点。例如，经典抗体是大而复杂的分子。它们具有杂四聚体结构，含有通过分子间二硫键和分子内二硫键连接在一起的两条轻链和两条重链。这种结构复杂性使得不能容易地在简单的原核系统中表达抗体，而需要在更为精细(和昂贵)的哺乳动物细胞系统中产生抗体。抗体的大尺寸也限制了其治疗效力，因为它们往往不能够有效穿透某些组织间隙。另外，治疗性抗体因为拥有Fc区，偶尔会触发不期望的效应细胞功能和/或凝血级联反应。另外，双特异性或多特异性抗体的制备往往涉及困难复杂的操作(参见例如Josefina等，(1997)，Nature Biotechnology，15：159-163；和Wu等(2007)Nature Biotechnology，25：1290-1297)。

从而本领域需要能够以高亲和力和特异性与期望靶标特异性结合的备选结合分子。也需要生产双特异性或多特异性结合分子的简单方法。

发明概述

本发明提供了可以与靶抗原特异性结合因而可用于广泛种类的治疗和诊断应用的、基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子。本发明基于意料不到的惊人发现，即含有至少一个修饰的底环的Fn3保留结构和构象稳定性，并能够与靶分子结合。此外，本发明还基于发现的新的双特异性基于Fn3的结合分子，其中单个Fn3分子能够通过利用Fn3的顶部和底部环而结合一个或多个靶分子。本发明还提供了简单有效的方法生成双特异性和多特异性基于Fn3的结合分子。

从而，在一个实施方案中，本发明涉及单特异性Fn3基结合分子，其利用底部AB、CD、EF环或C-末端结合一个或多个靶标，例如人血清白蛋白(HSA)、溶菌酶(“底部单特异性Fn3基结合分子”)。这些底部单特异性Fn3基结合分子能够连接在一起(例如以珍珠样方式)形成同时与多个靶标结合的多特异性Fn3基结合分子，和/或可与一个或多个非Fn3部分(例如功能部分)，例如人血清白蛋白(HSA)、抗体Fc区或聚乙二醇(PEG)，缀合，以例如提高Fn3基结合分子的半衰期和稳定性。

在另一实施方案中，底部单特异性Fn3基结合分子可与利用顶部BC、DE或FG环的Fn3基结合分子组合，以产生双特异性Fn3基结合分子。本发明还提供了同时与两个或更多个靶标结合的双特异性Fn3基结合分子。这些双特异性Fn3基结合分子还可连接在一起(例如以珍珠样方式)形成同时与多个靶标结合的多特异性Fn3基结合分子，和/或可与一个或多个如上文所述非Fn3部分(例如功能部分)缀合。本发明还提供了筛选Fn3基结合分子文库对靶标、一般是靶蛋白的特异性结合的方法，以及在例如原核或真核系统中制备Fn3基结合分子的方法。此外，本发明提供了包含Fn3基结合分子的组合物(例如治疗组合物)，以及此类组合物在多种治疗和诊断应用中的用途。

从而，一方面，本发明提供了包含Fn3结构域的Fn3基结合分子，其中与野生型Fn3结构域(例如SEQ ID NO：1)相比，该Fn3结构域在底部AB、CD、EF环区或C-末端之一个或多个中有至少一个氨基酸被改变，以产生与特定靶标结合的非Fn3结合序列。在一个具体实施方案中，底部AB、CD、EF环区或C-末端中改变的氨基酸残基包括SEQ ID NO：1第15、16、38、39、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、93、95或96位的一或多个氨基酸。该非Fn3结合序列可以是例如CDR区(例如抗体CDR区)或T细胞受体的全部或部分。