[发明专利]用于从试剂中去除核酸污染物的方法

说明书

技术领域

总体而言，公开的本发明涉及净化用于分析反应如核酸扩增反应或Sanger测序反应中核酸的DNA或RNA污染的试剂。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是允许指数扩增较长的双链核酸分子内核酸序列的方法。所述核酸可以是DNA或者是RNA。PCR可以通过首先使用逆转录酶将RNA转换成互补的DNA(cDNA)，然后用PCR扩增所述互补DNA从而扩增和检测RNA。为了定量检测靶核酸分子研发了实时PCR。一种监测PCR扩增过程的方法通过向PCR反应混合物中加入对双链DNA特异的荧光染料或者在实时PCR反应中使用经标记的探针而进行。荧光强度在PCR反应的对数扩增期过程中的每个热循环后加倍。SYBRGreen染料是一个结合至双链DNA而不是单链DNA的染料的一个例子并且经常用于实时PCR反应。

PCR是非常敏感的技术，其能够检测小至单个的靶核酸分子。但是，为了获得单个分子检测的敏感性和特异性，用于PCR中的试剂、材料和装置应该没有污染性核酸。典型的PCR主混合试剂(master mix reagent)混合物的成分包括但不限于至少热稳定的DNA聚合酶、dNTP、盐和可选地逆转录酶、荧光染料和各种添加剂。寡核苷酸引物(和探针)不掺入PCR主混合物中而是在进行PCR之前加入至PCR反应混合物中。商业上提供的一般PCR主混合物成分都不能在无细菌/无微生物和/或无细菌核酸条件下获得。事实上，在以细菌为靶标的PCR反应中已经观察到无模板对照(NTC)的C_T值。

用于PCR反应中的酶成分经常通过重组DNA方法制备。使用的聚合酶有细菌来源。因此，从商业供应商获得的PCR主混合物反应成分永远都不能完全保证没有微生物或微生物的核酸。因为PCR主混合物含有就生物性质和化学性质而言不同的成分，作为去除核酸污染物方法的过滤可以改变PCR反应混合物的一种或多种成分，引起PCR效率的降低。从单个PCR成分中纯化和去除污染性核酸是可行的，但是需要对每个类型的成分范畴开发和优化几种技术如大小排除、离子和亲和过滤。这增加了制造过程的复杂性和成本。

当处理DNA或RNA时，核酸的扩增、分离或纯化是目标。在核酸酶处理后残余核酸酶的存在可以破坏靶核酸模板，造成分离的核酸产率的降低，不能扩增或检测靶核酸序列和降解的分离的核酸。当使用核酸用于其中样品大小非常有限的诊断或法医应用时，靶核酸的纯度和稳定性也是严重的问题。降解靶核酸样品的污染性核酸的存在可以使得分析无效。另外，生物制药制造业要求制造过程引起的残余核酸或微生物的量最小化。污染性微生物和其核酸可以妨碍残余微生物和核酸水平的准确评估。因此本领域存在从用于研究、制造业、诊断、法医、核酸分离和纯化方法中的分子生物学和生物制药试剂和装置中去除污染性核酸的需求。

因此，建立没有微生物细胞和核酸的PCR主混合试剂盒是非常有挑战性的。

发明内容

本教导的一个具体实施方案包括从主混合试剂和其成分中去除核酸(例如污染性微生物核酸)的方法。所述方法使用加入至主混合物成分中或加入至主混合物本身(减掉引物和探针)的脱氧核糖核酸酶(DNase)或者是核糖核酸酶(RNase)的核酸酶。核酸酶可以作为溶液加入或结合至不溶性基质或固体支持物如选自磁珠、非磁性珠子、玻璃珠或纤维素珠上。可以通过过滤、离心或磁性分离去除固定的核酸酶。或者，核酸酶可以用热在孵育后失活。

本教导还提供了制备用于检测试剂或制药原材料和成品中痕量微生物污染物的实时PCR试剂盒的方法。为了说明，测试试剂盒中的所有试剂可以基本上没有污染性微生物和微生物核酸。本教导提供了有效的简单的从PCR主混合物或相似的含有具有不同化学性质的成分的试剂中同时去除污染性微生物和核酸的实现方法。

本教导还提供了去除PCR主混合试剂中核酸污染物的方法，所述方法通过以下进行：a)向PCR主混合试剂中加入核酸酶，b)在有效的温度下孵育含有核酸酶的PCR主混合试剂足够的时间从而消化污染性核酸(例如DNA)，和c)灭活核酸酶的活性。核酸酶起水解DNA或RNA分子的作用，所述DNA或RNA分子如果存在的话，在含有PCR主混合物的试剂成分中。

本教导还提供了在本主题方法的一些具体实施方案中固定在珠子上的核酸酶的用途。珠子选自磁珠或非磁性珠子。可以在完成核酸酶反应后通过离心、过滤或磁性分离将核酸酶-珠子复合物从试剂中分离出来。