[发明专利]分离聚羟基链烷酸酯的方法

说明书

本发明涉及一种从生产细胞中分离聚羟基链烷酸酯的方法。

i)分解所述生产细胞，然后

ii)通过连续射流分离器将细胞碎片与聚羟基链烷酸酯颗粒分离；

iii)用一种碱性水溶液洗涤浓缩的聚羟基链烷酸酯，然后

iv)用一种含水酸洗涤。

聚羟基链烷酸酯(PHA)——例如聚羟基丁酸酯(PHB)——可用细菌合成。例如，在Biopolymer，Wiley-VCH，2002中描述了这样的生物技术方法。

PHB在发酵末期以被蛋白质包膜包裹的颗粒形式存在于细菌细胞中(J.Biol.Chem.1989，vol.264(6)，3286-3291)。为获得足够纯的PHB，必须将其与细菌细胞分离。

用生物技术生产的粗混合物除了含有所需的聚羟基链烷酸酯外，还含有生产所述聚羟基链烷酸酯的微生物(生产细胞，生物质(biomass)，或非聚羟基链烷酸酯物质)。从生物质中分离聚羟基链烷酸酯的方法可以是a)溶解所述生物质，b)用合适的提取介质提取所述聚羟基链烷酸酯或c)将所述生物质(生产细胞)机械分解，然后将细胞碎片与所述聚羟基链烷酸酯(PHA)颗粒分离。

对此最常用的方法是利用溶剂将PHA颗粒从生物质中提取出来(处理b))。结果是使用溶剂有许多缺点。不得不投资复杂而昂贵的基础设施来处理和回收溶剂。提取出的生物质必须不含溶剂残余物才能进一步用作肥料或饲料。由于PHB在很多溶剂中仅能不充分地溶解，因而所需溶剂的量很多。

为分解和溶解所述生物质(处理a))，可使用例如酶或化学方法。此外，可加入表面活性化合物。可以多种方法组合使用。在Research In Microbiology 2005，156，865-873中描述了由基因修饰的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞形成的聚羟基丁酸酯(PHB)的释放，并在后文提到了细胞自溶步骤。未描述确切的细胞自溶条件。细胞自溶是细胞通过其自身的酶而自溶解的过程。这种制备方法有以下缺点。由于自溶进行不完全并且细胞碎片和PHB颗粒仍相互粘着，因而仅能释放大约80％形成的PHB。

WO 2007/135039描述了一种值得注意的机械处理c)。生产细胞通过一种高压均化设备分解并将生产细胞的细胞碎片通过射流分离器与形成的聚羟基链烷酸酯颗粒分离。当具有极高聚羟基链烷酸酯含量的生产细胞作为起始物时此方法非常有效。在其他情况下，分离除去细胞碎片(细胞壁)并不总是完全令人满意地成功。蛋白质(含氮)杂质导致颜色改变(参见Biotechnology Techniques，Vol.11，No.6，June 1997，page 411，左栏最后一段)并导致聚羟基链烷酸酯具有较低的热稳定性(Polymer Degradation and Stability 52(1996)，page 38，左栏)。

因此目标是寻找一种可将生产细胞的细胞碎片与形成的聚羟基链烷酸酯颗粒完全分离的方法。

此目标通过开篇处提到的4-步骤处理出色地实现。此方法因高效、经济可行性和卓越的处理能力而从常规方法中脱颖而出。

必需的设备在技术上可获得并且可根据需要放大，因此所述方法可容易地用于工业规模。

本发明的一个具体实施方案在步骤i)中通过机械方法分解生产细胞。无化学试剂的分解有其优点。已描述可用均化器分解PHB-生产细菌真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)的细胞(Bioseparation 1991，2，155-166)。存在于细胞中的PHB颗粒实际上在4次通过均化器后可与细胞基本完全分离。在此类均质器中，细胞悬浮液被挤压通过一个阀(valve)。通过调节阀锥和阀座之间的空隙宽度产生湍流。然后使从所述阀挤出的悬浮液冲击钢板。因此该机器的压力限制在1500bar。

为产生较高压力，需要大量电能。用均化器分解细胞是经济的，在细胞单次通过后即完全分解的情况下尤为如此。在Bioseparation 1991，2，155-166中描述的方法的缺点是需要4次通过均化器。

发明人现已证实，含有PHA的细胞，特别是真养产碱菌，可用以下描述的高压均化器容易地分解。在这种情况下，在2000bar或更高压力下单次通过所述高压均化器，可分解超过99％的细胞并且PHA基本完全释放。因此本发明还涉及使用一种在2000大气压或更高压力下运行的高压均化器的分解方法。例如，所述均化器包括以下配置：

合适的均化设备的实例：