[发明专利]用于测定角化结构中分析物的非蛋白水解方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年4月29日提交的美国专利申请第12/111,914号的优先权，其内容通过引用纳入本文。

技术领域

本发明涉及用于测定对象的角化结构中一种或多种感兴趣分析物的存在和含量的材料和方法，更具体涉及用于上述目的但不需要对所述角化结构进行蛋白水解加工的材料和方法。

背景技术

本发明涉及一种改进的分析方法，它允许较快地释放和直接分析毛发和其它角化结构如指甲和趾甲中存在的分析物，包括有机分析物，如某些滥用药物或其代谢物。该方法能够灵敏地检测这类分析物，而不影响该分析物的结构，不会对可用于检测该分析物的分析物探针如抗体、RNA/DNA和生物受体探针产生不利影响。例如，在一些实施方式中，分析物探针可直接加入怀疑含有一种或多种分析物且经过本文所述处理的角化结构中。可以此方式评价所述一种或多种分析物的种类以及对象消耗所述一种或多种分析物的程度和持续时间。

在感兴趣分析物的检测中，与尿液、血液或口腔液体的分析技术相比，分析毛发和其它角化结构有某些优势。这些优势包括容易处理和储存、检测窗宽以及药物的存在和含量与使用时间和摄入剂量相关联。尿液、血液和口腔液体技术的已知缺点包括无法确定使用或接触的持续时间和强度。这些技术至多提供有关摄入分析物的短期信息。此外，解释这些结果时也有问题。例如，在尿液中检测到低水平的摄入药物或药物代谢物可能表明对象最近摄入少量这种药物或几天前摄入较大量的这种药物。因此，在不重复检测的情况下，使用这些方法无法测定长期药物使用。

在对建立用于测定感兴趣分析物的持续时间和强度的精确可靠方法的问题的回应中，Werner A.Baumgartner博士进行的工作(参见“用于测定阿片类滥用历史的毛发的放射性免疫试验”(Radioimmunoassay of Hair for Determining Opiate Abuse Histories)，J.Nucl Med 20：749-752(1979))确定可通过分析哺乳动物体毛获得接触滥用药物的长期历史，因为在纤维合成期间这些物质被“嵌入”个体毛发纤维中。在这个方面，毛发能够像录音带那样工作，即可通过对毛发样品进行区块分析评价过往接触史。例如，曾发现一旦血流中出现吗啡，则会发现其随着毛发的合成进入毛发中。

经测定，各种化学物质，包括滥用药物均能够在毛发合成过程中俘获在毛发中；这些物质主要在躯体上存在毛发的时间“锁定”在毛发中。在头发和体毛，以及其它角化结构如指甲中发现这种现象；参见Suzuki等，Forensic Sci.International，24：9-16，1984。这些俘获的物质无法从毛发中洗出，曾认为只有在完全或接近完全破坏毛发纤维时才能完全释放这些物质。

以前从毛发中提取分析物的方法包括将毛发加入热的甲醇溶液中，或者在碱性或酸性介质中孵育毛发数小时(通常过夜)；Yegles，等，刊于：《在毛发中进行药物测试的分析和实践方法》(Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair)，CRC出版社，2007，第73-94页；Jurado，C.刊于：《在毛发中进行药物测试的分析和实践方法》，CRC出版社，2007，第95-125页；Cheze，M.等，刊于：《在毛发中进行药物测试的分析和实践方法》，CRC出版社，2007，第163-185页)。现有方法也包括使用超声波或杵臼和溶剂溶剂辅助提取。

在精确测定摄入分析物的存在和含量时，溶剂提取方法可能存在以下几个问题。这些问题之一是溶剂提取方法常常只去除毛发样品所含全部分析物中未知和可变的一小部分。另一缺点是不同分析物可能需要不同溶剂或不同时间和温度进行提取。此外，在免疫试验分析中，需要蒸发溶剂，许多溶剂是有毒有害的。

其它现有方法采用蛋白水解和还原性处理的组合来完全消化和降低角化结构，以便释放一种或多种分析物。参见例如，美国专利5,466,579；5,324,642；6,022,693；6,582,924；和6,949,344，通过引用将其全文纳入本文，这些文献提供了用于筛选和验证感兴趣分析物的实验的示范性检测方法，包括免疫试验方法，例如放射性免疫试验和酶促免疫试验方法的示范性检测方法。这类合并的蛋白水解和还原性处理方法虽然有效，但由于使用蛋白水解酶使得成本相当高，这也会干扰通过蛋白水解切割分析物检测探针如抗体进行的后续分析物检测实验，从而阻止某些高度灵敏的分析技术的应用或者需要在中间使用蛋白酶中和、分离或纯化步骤。