[发明专利]通过淀粉和木聚糖的降解酶的表达开发能进行淀粉和木聚糖的醇发酵的耐热酵母多形汉逊酵母菌株

说明书

发明人：安德烈·Y·沃罗诺夫斯基，查尔斯·阿巴斯，安德烈·希博尼 

优先权和通过引用并入 

本申请要求对2008年5月6日提交的美国临时申请第61/050,685号的优先权，该美国临时申请包括其中引用的所有参考文献(在本文重复)通过引用以其整体并入，以达到这些参考文献帮助理解本发明或帮助得到可促进本发明的实施的材料和方法的程度。如果引用的参考文献的内容与本申请的传授内容相冲突，应以本申请为准理解。 

技术领域

本申请涉及通过发酵进行纤维素乙醇生产的领域，具体地涉及淀粉和木聚糖碳源的发酵，更具体地涉及用于通过淀粉和木聚糖发酵进行乙醇生产的重组多形汉逊酵母(H.polymorpha)菌株，并且还更具体地涉及分泌重组的α淀粉酶和葡糖淀粉酶、和/或木糖水解酶和木糖苷酶以通过在含淀粉和木聚糖的培养基上进行发酵实现乙醇生产的多形汉逊酵母菌株。 

前言 

由可再生原料如植物生物质进行燃料乙醇生产具有重要的经济学和生态学意义。植物木质纤维素具有作为目前生物乙醇生产中被广泛应用的蔗糖和基于淀粉的多糖的替代性原料的潜力。木质纤维素和其他植物来源的多糖代表了一种可通过二氧化碳的生物转化进行再生产的可再生的持 续性能量来源。由植物生产的生物燃料胜过化石燃料的许多受追捧的环境益处之一是温室气体的显著减少[6，24]。 

目前世界上生产的绝大多数的乙醇来源于淀粉或蔗糖。许多农作物中富含淀粉和糖类，但是当乙醇作为一种液体交通运输燃料而扩大生产时，需要不与食物和动物饲料的使用直接竞争的原料。这些原料包括来自农业和林业上的木质纤维素副产品残余物[14]。 

木质纤维素是来源于木材和农业残余物的植物物质的通用术语。其主要包含木质素和纤维素以及大量的半纤维素，具有较少量的结构蛋白和有机溶剂可萃取的物质[14]。半纤维素是由作为骨架的木聚糖组成并且存在于植物细胞壁中的一种取代的多糖[11]。 

木质纤维素和淀粉加工成乙醇包括四个主要的单元操作：预处理，水解，发酵和产物分离/纯化。淀粉的生物转化包括酶水解和所得的葡萄糖发酵成乙醇，伴随动物饲料副产品的产生。由于木质纤维素具有较复杂的结构，并且在不同植物(谷类植物、软木材、硬木材等)和同一植物(茎、壳、秆、穗轴、秸秆、叶、核等)中的组成具有很大不同，因此木质纤维素的水解较为困难[14]。木糖是在具有C5L-阿拉伯糖和其他C6糖类如葡萄糖、甘露糖、半乳糖作为主要己糖的半纤维素成分水解得到的主要的戊糖[11]。 

由于木质纤维素的工艺涉及许多步骤，且需要高能量投入，因此，木质纤维素作为原料的商业生机需要开发更直接且廉价的技术。糖类聚合物的直接微生物转化(DMF，直接微生物发酵)是一种可使由木质纤维素生产生物乙醇的经济效益提高的选择。开发这项技术的关键先决条件之一是获得能够在高温下直接使淀粉和木聚糖发酵成乙醇的微生物[15]。目前DMF所涉及的水解酶的最佳温度约为50℃，而目前由木质纤维素糖类和淀粉糖类进行生物乙醇生产所用的绝大部分微生物为嗜温生物，其最佳生长和发酵温度在28℃到40℃之间[6]。 

本实验室的最近研究显示耐热的甲基营养型酵母多形汉逊酵母能够在高温(37-48℃)下使D-木糖和D-葡萄糖发酵为乙醇。因为多形汉逊酵母生长和发酵的最佳温度较高，所以它是用于DMF技术的深入开发的一 个优秀候选者[3，26]。由于多形汉逊酵母不能利用淀粉和木聚糖作为碳源和能量来源，所以异源木聚糖降解酶基因和淀粉降解酶基因在这种酵母中的克隆和过表达是必需的。