[发明专利]测量样品中活化因子Ⅶ含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用一种血浆来测量样品中活化因子VII(FVIIa)的含量的方法，该血浆缺少FVII以及至少一种选自于因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)和因子XI(FXI)的其它因子。

背景技术

血凝固是一种生物体在血管被伤害时控制出血的机理，并因此避免出血。

血凝固在一连串步骤之后发生，该系列步骤包括血液中的不同的酶原和辅因子原(procofactor)经由蛋白水解酶转换成它们的被活化的形式。在该凝固的连续步骤(或连串步骤)中，有两种不同的路径，即外源性的凝固路径和内源性的凝固路径。两者都导致被称之为凝血酶原酶的复合体的形成，该凝血酶原酶由被活化的因子X(FXa)、被活化的因子V(FVa)、磷脂质以及钙所构成。凝血酶原酶将凝血素活化为凝血酶，使得可溶性的纤维蛋白原转换成形成血块的不溶性的纤维蛋白。

外源性路径包括血浆中存在的FVII的介入。然而，后者必须先被活化成FVIIa以便开始凝固的连串步骤。单独的FVIIa(未与组织因子复合)表现出低的蛋白水解活性。当FVIIa与组织因子(TF)，一种在血管损害过程中释放的与磷脂质有关的蛋白复合时，这一活性被增强。FVIIa-TF复合物在钙离子存在的条件下将因子X转换成因子Xa。FVIIa-TF复合物还将FIX转换成FIXa。

反过来，因子IXa和Xa将FVII活化为FVIIa。与因子Va和磷脂质复合的因子Xa(凝血酶原酶)将凝血素转换成凝血酶。凝血酶作用于纤维蛋白原，将其转换成纤维蛋白，同时还进行其它活动，包括将因子V活化成因子Va，将因子FVIII活化为FVIIIa。在钙存在的条件下，凝血酶还将因子XIII活化为能巩固纤维蛋白血块的因子XIIIa。

虽然在外源性凝固路径中，FIX被FVIIa/TF复合体活化成FIXa，在内源性凝固路径中，FIXa由FXIa从FIX获得，FXIa本身是通过血液与一负电表面例如内皮下层的接触由因子XII所活化。

因此FVIIa，一种依赖于维生素K的糖蛋白，在导致血块形成的凝固机理中起着显著的作用。在组织被损害引起出血后所释放的组织因子存在的条件下，即使没有因子VIII或者IX，FVIIa也具有能够在局部起作用的优点。这就是许多年以来FVIIa被用来治疗某些凝固失调的原因，这些凝固失调本身通过出血而显示出来。

第一种方法是从血浆中获得FVIIa。然而，从血浆中制造FVIIa受到供源可获得性的限制，且血浆的这一用途具有传播病原体的风险，例如传播朊病毒和病毒。这些问题已经被诺和诺德药业(Novo Nordisk Pharmaceuticals)开发出的重组FVIIa(rFVIIa)所解决，该重组FVIIa是结构上类似与血浆FVIIa的一种糖蛋白。

rFVIIa的主要治疗适应症(在美国、欧洲和日本)涉及具有成熟抗-因子VIII抗体的A型血友病患者和具有成熟抗-因子IX抗体的B型血友病患者的自发或手术出血的治疗。在欧洲，其适应症还涉及对具有先天FVII缺陷的病人以及Glanzmann血小板机能不全病人的用途。

此外，许多出版物报道了rFVIIa对先天凝血因子缺陷或者血小板机能不全病人在外科手术过程中控制出血的功效。

FVIIa的不断增长的广泛用途导致要更新方法以便：

(1)测量FVIIa的活性

(2)确定FVIIa的浓度

(3)测量被活化的FVII的含量

用于检测FVII活性的最有名的方法是测量凝固时间、PTT(部分凝血活酶时间)、aPTT(活化部分凝血激酶时间)、TEG(血栓弹性)和TGT(凝血酶生成测试)。这些方法使得FVIIa活性的检测成为可能，但是迄今为止都不能直接检测样品中被活化的FVII的含量。

市场上有用于FVIIa的免疫学检测的商用试剂盒(IMUBIND因子VII酶联免疫试剂盒)，但是实施该技术的实验条件难于掌握。事实上这种试剂盒使用复杂，具有非常窄的动态范围、极其有限的线性检测范围，最重要的是需要在4℃的温度下工作。