[发明专利]用于动物细胞的重组表达载体

说明书

【技术领域】

本发明涉及用于动物细胞的重组表达载体，被所述载体转化的细胞系，及使用所述细胞系制备靶蛋白的方法。

【背景技术】

一般而言，作为工业上用于过表达靶蛋白的技术优选动物细胞培养。因为有工业价值的蛋白大多是人或动物来源的蛋白，且特异性蛋白修饰机理(糖基化，磷酸化，酰胺化)容易在动物细胞内进行。目前用于工业的动物细胞是CHO(中国仓鼠卵巢)，BHK(幼仓鼠肾)及骨髓瘤细胞，其中，类似于基于微生物的表达系统，通过将表达载体转染进所述细胞来表达靶蛋白。

但是，动物细胞的缺点在于，相比微生物中的表达，显示低水平的转染的外源基因表达。用于克服此缺点的广泛用于工业的系统是使用二氢叶酸还原酶(DHFR)基因及其基因活化抑制剂，甲氨喋呤(MTX)的外源基因扩增系统。此系统基于，将编码靶蛋白的基因与编码选择性标记物(DHFR蛋白)的基因插入染色体DNA的相同区，则当人为逐步增加MTX浓度时，附近定位的外源基因与细胞系中对于生存必要的DHFR基因同时扩增的现象。

已有报道，当用MTX处理时，表达载体内的DHFR基因与附近定位的基因同时扩增(Kaufman et al.Mol Cell Biol.Jul；5(7)：1750-9(1985))，还有报道称，插入表达载体内DHFR基因附近的外源基因在动物细胞内以高水平共表达(Alt et al.Cold SpringHarb Symp Quant Biol.42Pt 2：649-57(1978)；美国专利No.4656134)。

基因扩增通常是非常罕见的现象，但有迹象表，可通过选择抵抗连续增加的MTX浓度的细胞实现获得基因扩增的细胞，MTX抗性集落形成耗时约3～4周，且使用变动于50nM～500mM的MTX浓度实现工业上显著水平的扩增需要几个月的时间和几个阶段的扩增过程。

但是，在使用MTX处理的诱导基因扩增处理期间，随着阶段性增加的MTX浓度，可在细胞系生长速率及产率上发生问题，有报道称，即便实际增加MTX浓度，重组蛋白表达非但不增加，反倒减少(Kaufman et al.Mol Cell Biol.J；5(7)：1750-9(1985))。类似地，最近有报道称，通过突变表达载体内的DHFR基因控制因子序列可显著增加MTX的基因扩增效果(Bai et al.Zhonghua Yi Xue Za Zhi.Feb25；83(4)：333-7(2003))。

在本申请通篇参考了多个论文及专利文献，及标出了其引用。将引用的论文及专利文献的公开内容通过引用整体并入本说明书，以更完全说明本发明所属领域的水平及本发明的内容。

【发明概述】

本发明人为解决使用经含DHFR基因的载体转化的动物细胞的蛋白的表达中的低表达率的问题，基因扩增诱导过程中利用的高浓度的甲氨喋呤所致的低水平的细胞系生长速率及产率的问题进行了锐意研究。结果，本发明人开发出通过使用含可操作连接于小鼠来源的DHFR启动子的人DHFR基因序列的重组载体，由此即使以更低浓度的甲氨喋呤，也可诱导外源基因的有效扩增而大量获得外源蛋白的用于动物细胞的重组表达载体，从而完成本发明。

因此，本发明旨在提供用于dhfr^-动物细胞的重组表达载体。

本发明还旨在提供经所述载体转化的dhfr^-动物细胞系。

本发明还旨在提供使用所述转化的dhfr^-动物细胞系制备蛋白的方法。

本发明的其他目的及优点将从以下发明详述、权利要求书及附图而显而易见。

根据本发明的一实施方式，本发明提供用于dhfr^-动物细胞的重组表达载体，其包括：(a)包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所列的核苷酸序列的二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子；及(b)可操作连接(operatively linked)于所述启动子的DHFR-编码核苷酸序列。

本发明人为解决使用经含DHFR基因的载体转化的动物细胞的蛋白的表达中的低表达率的问题，基因扩增诱导过程中利用的高浓度的甲氨喋呤所致的低水平的细胞系生长速率及产率的问题进行了锐意研究。结果，本发明人开发出通过使用含可操作连接于小鼠来源的DHFR启动子的人DHFR基因序列的重组载体，由此即使以更低浓度的甲氨喋呤，也可诱导外源基因的有效扩增而大量获得外源蛋白的用于动物细胞的重组表达载体。

本文所用的术语“DHFR(二氢叶酸还原酶)”指将二氢叶酸还原成四氢叶酸的酶，是核酸合成中的必要酶，且是细胞生长中的必要酶。