[发明专利]可溶性重组流感抗原

说明书

发明领域

本发明涉及可溶性重组流感抗原的产生。更具体地，本发明涉及保持免疫原性的可溶性重组流感抗原的产生。

发明背景

流感是由呼吸系统病毒导致的人类死亡的首要原因。常见症状包括发烧、咽喉疼痛、呼吸短促以及肌肉酸痛等。在流感季节，流感病毒感染世界人口的10-20％，每年导致250-500,000例死亡。

流感病毒根据存在的核蛋白和基质蛋白抗原分为甲、乙或丙型。甲型流感病毒可根据存在的血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)表面糖蛋白的组合进一步分成亚型。HA决定着病毒结合和进入宿主细胞的能力。NA从宿主细胞和病毒表面蛋白的多糖链上除去末端唾液酸残基，所述唾液酸残基防止病毒聚集并促进病毒运动。目前，已确认16种HA(H1-H16)和9种NA(N1-N9)亚型。每种甲型流感病毒存在一种类型的HA和一种类型的NA糖蛋白。一般来讲，每种亚型都显示物种特异性；例如，已知所有HA和NA亚型都感染鸟类，而只有H1、H2、H3、H5、N1和N7表明感染人。认为含H5和H7的流感病毒为甲型流感病毒的最强致病形式，并且最可能引起未来的大流行。

流感大流行通常由高传播性和毒力的流感病毒引起，并且可导致全球更高水平的疾病和死亡。新甲型流感病毒亚型的出现在20世纪引发了4次主要大流行。1918-1919年由H1N1病毒引起的西班牙流感在1917至1920年间导致全球超过五千万人死亡。出现新亚型或动物特有的亚型传播到人的风险始终存在。尤其关注的是高度毒力形式的鸟类流感(也称为“禽流感”)，其爆发已在全世界几个国家中有报道。在很多情况下，该禽流感可在48小时内导致将近100％的死亡率。已假定禽流感病毒(H5N1，其在1997年在香港首次鉴定)在其它亚洲国家和欧洲的传播与野生鸟类的迁移模式相关。

越来越得到关注的问题是，病毒可能变得对人具有高度感染性。人类健康的主要问题在于流感病毒抗原性不稳定这一事实，即它们快速变异。如果禽流感病毒与人病毒接触，则该鸟类病毒的遗传重排可产生高致病性的流感病毒，其可在人中引起严重的疾病或死亡。而且，这种突变还可导致流感病毒在人中顺利地传播。

抗击人中流感的现行方法为每年接种。每年世界卫生组织选择3种病毒株纳入当年度的在受精卵中生产的流感疫苗中。然而，每年生产的疫苗剂量并不足以接种全世界人口。例如，加拿大和美国可获得足够免疫其约三分之一人口的疫苗剂量，而在欧盟只有17％的人口可被接种。很显然，当面临全球流感大流行时全球的流感疫苗生产将不足。因此，政府和私人企业等已将注意力转向有效流感疫苗的生产上。

如上所述，目前获得流感病毒疫苗的方法是通过在受精卵中生产。将病毒在受精卵中培养，而后灭活病毒并纯化病毒糖蛋白。尽管该方法保持了抗原表位和翻译后修饰，但有几个缺点，包括由于采用全病毒而导致的污染风险，以及产量根据病毒株不同而变化。不理想的防护水平可能由于病毒被引入卵中所导致的其遗传异质性而引起。其它缺点包括获得卵所需的大量工作、由于在纯化中使用的化学物导致的污染风险，以及生产时间长。还有，对卵蛋白过敏的人可能不是接受疫苗的合适候选者。

为了避免卵的使用，还在哺乳动物细胞培养中生产了流感病毒，例如，在MDCK或PERC.6等细胞中。另一个方法为反向遗传学，其中通过用病毒基因转化细胞产生病毒。然而这些方法也需要采用完整病毒，并且方法复杂，以及需要特定的培养环境。

已经研究了病毒DNA作为疫苗的应用。在该技术中，通过在人细胞中表达病毒抗原获得保护；随后抗原被识别为外来抗原，这导致特异性的抗体应答。然而，存在将DNA引入人细胞基因组决定性部分而使癌基因激活的风险-这是重大的缺陷。

Dow Agroscience也制备了包含用病毒DNA转化的昆虫或植物细胞表达的重组病毒抗原的疫苗(例如见WO2004/098530)。尽管避免了与采用活病毒相关的风险，并且缩短了生产过程，但是蛋白构象和翻译后修饰仍受到影响。放大和纯化步骤也相对复杂，因为抗体与细胞膜相结合。此外，有效免疫动物所需的杆状病毒重组HA的剂量比受精卵中产生的天然HA的剂量高10倍。在两种情况下，病毒抗原表达水平都很低。