[发明专利]细胞分化方法及其在血管建立中的应用

说明书

本发明涉及细胞分化方法及其在血管建立中的应用。本发明还涉及特定氧浓度用于实施细胞分化方法的用途。

在发育生物学中，细胞分化是指特化性较低的细胞变成特化性较高的细胞类型的过程。在多细胞生物体发育过程中，随着生物体从单个受精卵变成组织和细胞类型的复杂系统，会发生多次分化。分化也是成体中的常见过程：在组织修复和正常细胞周转过程中，成年干细胞分裂并产生完全分化的子代细胞。细胞分化引起细胞的大小、形状、极性、代谢活性和对信号的响应性的显著改变。这些改变很大程度上是由于基因表达的高度受控的修饰造成的。除了几个例外以外，细胞分化几乎从不涉及DNA序列本身的变化。因此，不同的细胞可以具有差别非常大的物理性质，虽然它们具有相同的基因组。

能够分化成很多细胞类型的细胞称作多能的(pluripotent)。这些细胞在动物中被称为干细胞。能够分化成所有细胞类型的细胞称作全能的。在哺乳动物中，只有受精卵和早期胚胎细胞是全能的。

当精子和卵子发生受精作用并产生具有形成完整生物体的潜力的单个细胞时，发育开始。在受精后的前几个小时，该细胞分裂成相同的细胞。在人类中，在受精后大约4天和细胞分裂数个循环之后，这些细胞开始特化(specialize)，形成细胞的空心球体，称为胚泡。胚泡具有外层细胞，在空心球内有称作内细胞团(inner cell mass)的细胞簇。内细胞团的细胞将继续形成最终的人体的所有组织。虽然内细胞团的细胞最终可以形成人体中发现的每种类型的细胞，但是它们不能形成生物体。这些细胞被称作多能的。

多能(pluripotent)干细胞经过进一步的特化成为多潜能(multipotent)祖细胞，然后，多潜能祖细胞产生功能细胞。干细胞和祖细胞的实例包括：

●来自骨髓的造血干细胞(成年干细胞)，其产生红细胞、白细胞和血小板；

●来自骨髓的间充质干细胞(成年干细胞)，其产生基质细胞、脂肪细胞和多种类型的骨细胞；

●上皮干细胞(祖细胞)，其产生多种类型的皮肤细胞；

●肌卫星细胞(祖细胞)，其促成分化的肌肉组织。

生物体中每种特化的细胞类型表达构成该物种的基因组的所有基因的亚集。每种细胞类型由受调节的基因表达的特定模式所定义。因此，细胞分化是细胞从一种细胞类型到另一种类型的转化，其涉及从一种基因表达模式到另一种的转换。一些进化上保守类型的分子过程通常参与控制这些转换的细胞机制。控制细胞分化的主要类型的分子过程涉及信号传导。在控制细胞分化过程中将信息从一个细胞传递到另一个细胞的很多信号分子被称为生长因子。另一个重要的策略是使亲代细胞内的分子分化控制信号不平均地分配。胞质分裂之后，此类细胞内分化控制信号的数量在子代细胞中是不平均的，这种不平均会导致不同子代细胞的分化的不同模式。广泛研究的实例是果蝇中的身体轴线模式的研究。RNA分子是一种重要的细胞内分化控制信号。

体外扩增，即增殖，以及分化过程在本领域中已进行了深入研究。尤其是用于富集造血干细胞的造血干细胞增殖培养条件是熟知的。

例如，WO 2007/049096公开了扩增造血干细胞并允许其向内皮细胞分化的方法。该方法包括在特定培养基中体外培养干细胞，其中所述干细胞附着到允许/增强其向内皮细胞分化的载体上。

此外，该文献未提及使用CD34-阳性抗原纯化的干细胞可以提供除了内皮细胞之外的其它附着细胞。

所以，虽然科学家对于分化过程的了解越来越多，但是细胞分化的机理和命运仍待阐明。

此外，本领域中尚无文献报道允许从干细胞向分化的细胞分化的方法或特定条件的使用，其中所述分化的细胞在天然生物学过程中不是衍生自所述干细胞。

需要提供一种简单的、独特的或准独特的程序以使干细胞分化为所有想要的分化的细胞。

该需求对于手术治疗和处理与分化过程改变相关的病症、或损伤后器官重建是特别重要的。

尤其重要的是提供工程化组织(例如血管)以治疗患有心血管病或血管疾病(例如栓塞、中风)的个体。

所有的血管都具有相同的基础结构。从内至外有三个层：

·内膜(最薄的层)：通过多糖细胞间基质粘合在一起的单层的简单磷状内皮细胞，周围是内皮下结缔组织的薄层，交错着很多循环排列的弹性带(称为内弹力膜)。

·中膜(最厚的层)：循环排列的弹性纤维、结缔组织、多糖物质，第二层和第三层被另一个厚的弹性带(称作外弹力膜)分开。中膜(尤其是动脉中的中膜)可以富含血管平滑肌，其控制管径。

·外膜：完全由结缔组织构成。它还包含提供肌肉层的神经，以及更大的血管中的营养毛细血管(血管滋养管)。