[发明专利]生产糖胺聚糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生产糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)组合物的方法，优选包括抗凝血糖胺聚糖的组合物，如肝素。尤其优选从非哺乳类海洋动物中提取的糖胺聚糖组合物，如鱼类或磷虾。

背景技术

糖胺聚糖包括两个亚类，即半乳糖胺聚糖(galactosaminoglycan)和葡萄糖胺聚糖(glucosaminoglycan)。肝素是给一类具有抗凝血特性的硫酸葡萄糖胺聚糖的名称。除了肝素之外，其它的抗凝血硫酸葡萄糖胺聚糖(通常被称为类肝素(heparinoid))也被熟知，例如硫酸乙酰肝素(heparan sulphate)。这些也被用于实现抗凝血或抗调理作用(anti-opsonization)效果。然而，肝素是此类中最具商业重要性。

抗凝血糖胺聚糖是具有重复的硫酸二糖单元的多糖，其多糖结构可以另外包含其它的寡糖亚结构，例如现已知的结合于抗凝血酶的戊糖单元。因此，除了其三硫酸二糖重复单元外，肝素还含有另外的寡糖单元，如二硫酸寡糖。而且一些肝素包含作为抗凝血酶高亲和结合位点的戊糖，含有这种抗凝血酶戊糖结合位点的肝素为高亲和肝素。

不同的糖胺聚糖在糖间键(inter-saccharide bond)和糖环替代物上不同。此外，对于特定的动物物种，链的长度会变化。因此，糖胺聚糖具有一定的分子量分布而不是特定的分子量，即它们是多分散的。

肝素具有聚合性结构，因此肝素组合物通常包含具有一定分子量范围的肝素，典型地从3kD至40kD。具有这样宽分子量范围的肝素通常被称为未分级肝素(unfractionated heparin，UFH)。作为目前在商业上所用的，未分级肝素典型地具有在5.0到40kDa范围内的分子量。

近年来低分子量肝素(LMWH)，即含有低分子量肝素的材料的生产和使用受到极大的关注，所述低分子量典型地小于8kDa，尤其是至少60％(摩尔百分比)具有低于8kDa分子量的肝素。低分子量肝素具有至少70单位/mg的抗Xa因子活性效力，抗Xa因子活性与抗IIa因子活性的比值至少为1.5。

低分子量肝素可以通过多种方法从天然的未分级肝素中生产，例如，通过化学裂解或酶促裂解进行分级或解聚，如通过亚硝酸解聚、用过氧化氢进行氧化解聚、用亚硝酸异戊酯进行去氨基裂解、肝素苄酯的β-消除碱裂解(alkalinebeta-eliminative cleavage)、用Cu²⁺和过氧化氢进行氧化解聚或者通过肝素酶消化。

极低分子量肝素(VLMWH)的合成生产也得到越来越多的关注。我们先前已经公开过从海洋动物，特别是鱼类提取的肝素天生地具有高含量的低分子量肝素，而且，令人惊奇地还具有高含量的极低分子量肝素，即具有分子量少于3kDa的肝素(见WO 2006/120425，该专利的内容在此引入作为参考)。

鉴于已被察觉的跨物种的病毒和朊病毒感染的可能性，对于源自哺乳动物的糖胺聚糖的应用越来越关注。海洋的糖胺聚糖(例如，从海洋动物中提取的肝素)因此提供了替代品。海洋的肝素的提取在WO 02/076475中有描述，该专利的内容在此引入作为参考。

以前的从海洋的材料中提取糖胺聚糖的方法包括离子交换层析、电泳分离、在不同的有机溶剂中连续沉淀和许多其它方法，包括那些在从动物源中提取的现有技术中描述的方法。这些技术中的很多技术是耗费时间的、效率低的。因此，存在海洋源糖胺聚糖生产的替代方法的需求。例如，AT-琼脂糖凝胶层析只能提纯肝素中的高亲和部分，而申请人已经发现常规的基于珠体的离子交换系统(bead-based ionexchange system)也能结合不需要的化合物，如脂类。此外，在这些已知的技术中，冲洗必须持续的进行一段时间，而且为了将糖胺聚糖从层析柱上洗脱需要大量的缓冲溶液(这使得进一步处理费力)。这会导致诸如氧化、沉淀、失活等问题。

申请人进一步确认从海洋动物材料来的糖胺聚糖的提取的现有方法可能遭遇一些问题，如不能实施的长处理时间(即多达几天，那样能导致腐烂的鱼废弃物发臭)，最终产品的低的总体活性。

因此，鉴于海洋的肝素的上述优点，但与目前的提取方法相关的问题，存在海洋源糖胺聚糖生产的替代方法的需要。我们已经惊奇的发现，在从非哺乳类海洋动物材料来的糖胺聚糖的提取中，利用层析基质，如膜吸附器，特别是阴离子交换膜吸附器进行层析给常规提取技术提供了合适的替代。该技术容易按比例放大和自动化，而且还惊奇地发现具有突出的纯度和高活性的产品能被简单并高效地生产。

发明内容