[发明专利]用于在表达HBx的哺乳动物细胞中生产重组蛋白的方法和组合物

说明书

提及相关申请

本申请要求2008年5月28日提交的美国临时申请号61/056,634的优先权。

序列表

本申请包括纸印本和电子本的序列表两者。申请人保证电子本的序列表中含有的主题与纸印本中呈现的相同。

发明领域

一般而言，本发明涉及通过表达乙肝病毒X蛋白(HBx)的重组哺乳动物宿主细胞来生产异源蛋白质的组合物和方法。

发明背景

对重组蛋白(包括治疗性蛋白质)的需要是迫切的(acute)，而且持续需要改善重组蛋白的生产效率。在商业生产过程中提高蛋白质产量仍是一项有意义的挑战。

已经报告了用HBx质粒的瞬时转染可以导致上调Huh7和Chang肝癌细胞表达异源淋巴毒素alpha。Lee等，Biochim Biophys Acta 1741，75-84(2005)。另外，用HBx稳定转染的Chang肝癌细胞可以具有淋巴毒素alpha的上调表达。

还已经报告了在哺乳动物肝癌悬浮细胞中，用HBx的转染可以以剂量依赖性方式降低E-钙粘着蛋白表达水平。Lee等，Oncogene 24，6617-6625(2005)。

分泌型和膜蛋白质通常在宿主细胞的内质网(ER)-高尔基系统中经历折叠和其它翻译后修饰。未折叠蛋白质响应(UPR)信号传导途径的功能是感测未折叠蛋白质水平，并随环境变化诸如ER应激调节细胞的蛋白质折叠和分泌能力。Bernales等，Annu.Rev.Cell Develop.Biology 22，487-506(2006)。ER应激是ER折叠蛋白质的能力变为饱和的条件。IRE1(肌醇需要酶1(inositol-requiring enzyme 1))和ATF6(转录激活因子6)是细胞内部的未折叠蛋白质的两种主要的感应物，并且目前了解为是UPR的关键转导物。Credle等，Proc Natl Acad Sci USA 102，18773-18748(2005)；Nadanaka等，Mol.Cell.Biology 27，1027-1043(2007)。

这些代谢途径是由许多病毒基因激活的，所述病毒基因包括：a)人巨细胞病毒27kDa ER驻留的I型膜糖蛋白(在短的独特区11(US11)内)，其靶向主要组织相容性复合体(MHC)I类分子以自ER变位至胞质溶胶；b)由丙肝病毒(HCV)编码的非结构蛋白NS4B，其在物理上与CREB-RP/ATF6β相互作用，而且通过诱导XBP1剪接来激活ATF6和IRE1途径。Zheng等，J.Microbiology43，529-536(2005)；和c)小的可读框X基因内的乙肝病毒17kDa蛋白(HBx)，其是调节多种细胞事件诸如细胞周期、存活、和凋亡的多功能转录激活物。

IRE1(即一种内源外切核酸酶)可以修饰X框结合蛋白mRNA(XBP1)以形成剪接的XBP1mRNA(XBP1s)，这导致翻译移码，其产物激活经由UPR途径的蛋白质分泌升高。Tigges等，Metab.Eng.8，264(2006)。Tigges等进一步披露了用XBP1和XBP1s转染细胞以提高分泌能力，用于分泌性蛋白质治疗剂的生物药物制备。Tigges等还教导了用XBP1s质粒和编码分泌性胚胎碱性磷酸酶(hSEAP)、分泌性激素VEGF、或分泌性α-淀粉酶的基因瞬时转染可以分别导致hSEAP、VEGF、和α-淀粉酶的蛋白质生成。

通过多种技术来生产重组蛋白，包括在固体基质上、在悬浮的微载体上、和对于不依赖贴壁细胞以非粘附悬浮培养方式培养宿主细胞。粘附培养包括在可以在悬浮液中维持的微载体上培养。在不依赖贴壁细胞的悬浮培养中，不将细胞附着至基质，而是以悬浮方式在合适的反应容器内在含有营养物的培养基中维持。

利用各种悬浮方法来生产并维持特定的宿主细胞。对于微载体和不依赖贴壁细胞的典型悬浮细胞培养方法使用摇动器、滚筒、搅拌器、或气升系统，它们搅动培养中或生物反应器中的细胞培养基和细胞。可以控制并调节通风、温度、搅动率等条件以提供对培养物生长和重组蛋白的高生产有利的条件。

发明概述

本发明利用关于使用HBx来提高由哺乳动物细胞的细胞培养物进行的异源(重组)蛋白质生产的某些意想不到的发现。在其各个实施方案中，本发明提供了用于生产重组蛋白的方法和组合物，其通过在也表达重组蛋白的哺乳动物宿主细胞中表达HBx来进行，由此与不表达HBx的相当的重组细胞相比在此类细胞中提高重组蛋白的生成。