[发明专利]表达载体及其方法

说明书

发明领域

本发明涉及表达重组可溶性蛋白质的载体和化合物。更具体而言，本发明涉及表达重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgG Fc融合蛋白的核酸分子、表达载体和宿主细胞。本发明还涉及一种采用所述表达载体转染的宿主细胞制备重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(TNFR)-人IgG Fc融和蛋白的方法。

发明背景

1986年，美国食品药品管理局(FDA)批准将来自哺乳动物细胞的人组织纤溶酶原激活物(tPA，美国加利福尼亚州基因泰克公司(Genentech，CA，USA))蛋白用于治疗目的。细胞培养和重组DNA技术的进步推动了采用遗传工程细胞表达具有治疗或其它经济价值的各种类似蛋白质。目前存在若干单克隆抗体已获得治疗应用的批准，几百种抗体处于研发和批准的各阶段。和tPA类似，这些蛋白质大多数在无限增殖化的中华仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，但其它细胞系如小鼠骨髓瘤(NS0)、幼仓鼠肾(BHK)、人胚胎肾(HEK-293)细胞系也获得了生产重组蛋白质的批准。

很多来自高等真核生物来源的生物活性治疗物的表达常需要低等真核细胞或原核细胞中不天然产生的转录后修饰，由此需要使用来自高等真核生物来源的细胞。因此，通常优选哺乳动物表达系统制备大多数治疗蛋白质，因为细胞系中也进行所需转录后修饰。现在可将各种哺乳动物细胞表达系统用于蛋白质表达。表达载体通常采用强病毒或细胞启动子/增强子以驱动重组基因的表达。然而，哺乳动物细胞中的这些表达载体/系统达到的重组蛋白质的表达水平在商业生产中不具可行性。治疗物生产中存在两个关键问题需要解决：(a)提供所述材料消耗的时间；(b)降低所述材料的价格以便进行大量生产，特别是在发展中或不发达国家。因此，生物技术产业持续着眼于可降低时间和成本的新的技术和工艺开发策略。

恩利(ENBREL)(依那西普(Etanercept))也称为TNFR:Fc融合蛋白，是一种包含人肿瘤坏死因子受体超家族成员1B(p75)的胞外结构域和人IgG1的Fc结构域的重组融合蛋白。它是类风湿性关节炎治疗的重大科学进步，在很多患者中显示减轻类风湿性关节炎、多关节型青少年类风湿性关节炎、关节强硬性脊椎炎、牛皮癣性关节炎和牛皮癣的病征和症状。肿瘤坏死因子(TNF)是天然产生的参与正常炎症和免疫应答的细胞因子。它在类风湿性关节炎(RA)、多关节型青少年类风湿性关节炎(JRA)的炎症过程和所产生的关节病理学中具有重要作用。在RA患者的关节液中发现TNF水平升高。

由于重组基因的遗传稳定性低和/或重组基因的沉默，可能难以在哺乳动物细胞中生产重组蛋白质如TNFR:Fc。已报道了可引起基因沉默的若干分子机制，包括DNA甲基化、负位置效应、整合依赖性阻抑作用等，仅举此数例。

因此，本领域需要克服已知的生产重组融合蛋白方法的缺陷，在这样的蛋白质的大规模生产中提供具有较高遗传稳定性的表达系统。为促进从细胞培养物生产大量TNFR:Fc，开发了一种新的表达载体。采用该表达载体已显示可增加治疗蛋白质的表达。本发明描述了TNFR:Fc的克隆、表达和纯化。

发明概述

本发明包括所附权利要求书所述的一种或多种特征和/或以下特征，这些特征的单独或组合形式可包含可获得专利的主题：

本发明基于对新的支架/基质结合区(S/MAR)序列的发现，所述序列可用于增加和稳定哺乳动物和其它真核细胞中重组蛋白质的表达产量。所述S/MAR序列增大邻近转录盒的遗传稳定性并通过干扰诸如DNA甲基化等机制来抑制基因沉默。此外，认为S/MAR序列的存在通过降低位置效应而降低克隆的变化。

因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的核酸，其具有选自下组的一个或多个核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，它们的变体和功能性片段，以及与它们具有至少70％同源性的序列或在严格条件下与所述分离核酸杂交的序列。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种表达载体，其携带一个或多个支架/基质结合区(S/MAR)序列和它们的任何组合。所述S/MAR序列可选自下组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，它们的互补序列、变体和功能性片段，以及与它们具有至少70％同源性的序列，所述同源性采用匹配方法如BLAST(基本局部比对搜索工具)算法进行成对DNA序列比对测定。