[发明专利]新的调控组件

说明书

技术领域

本发明系关于细胞培养技术领域。本发明系关于新的调控组件，以及自诸如克隆化基因等核酸改良多肽之表达的方法，及在使用该等新颖调控组件的真核宿主细胞中生产各种多肽。

背景技术

供人类治疗使用之生物药物之市场继续以高速率增长，其中逾900种生物药物正在临床研究中进行评估且估计2010年销售额为500亿。当前，愈来愈多之生物药物系自哺乳动物细胞中生产，原因在于哺乳动物细胞能够正确加工并修饰人类蛋白质。因此，重组蛋白质在功能与药效方面皆与人类兼容。与原核表达系统相比，缺点通常为蛋白质表达量大幅降低。因此自哺乳动物细胞中成功且高产量生产生物药物至关重要，且视包括以下之各种因素而定：宿主细胞系、表达系统、细胞生长及生产力、培养及肴料培养基、生产及纯化程序、蛋白质结构及序列、蛋白质稳定性及配方。

表达重组蛋白质需要编码所要目标基因的表达载体。多种方法可用于优化表达载体以便进行有效蛋白质生产。基因表达系在转录及转译水平加以调控。因此，许多方法系关于鉴别及优化强启动子及增强子以提升蛋白质编码基因之转录效率。此等启动子及增强子之实例为CMV即刻早期启动子及增强子、SV40启动子及增强子、延伸因子(EF)启动子、多瘤病毒增强子及鸡[β]-肌动蛋白启动子。同样，亦使用稳定mRNA并强化转录终止之强聚腺苷酸化信号序列、经由表达载体所编码之基因增强蛋白质表达。提升所得mRNA之转译效率的方法为使用转译起始位点(AUG)、最佳核糖体结合位点(诸如Kozak序列(GCCGCCACCAUGG，AUG构成起始密码子))或内部核糖体进入位点(IRES)。

用以优化表达载体以便在真核细胞中获得更高量之重组基因表达之方法之一系关于聚腺苷酸化信号之使用及选择。多种聚腺苷酸化信号可用于载体中以便表达重组蛋白质。最常用之聚腺苷酸化信号包括例如来自牛生长激素(BGH)(美国专利第5，122，458号)、猴病毒40晚期及早期区、兔β-血球蛋白、小鼠或人类免疫球蛋白、多瘤病毒晚期区的聚腺苷酸化信号。

在真核信使RNA(mRNA)中，3′非翻译区(3′UTR)为重要调控组件。在多种情形下，其控制mRNA稳定性，且其亦可调控转译效率。聚腺苷酸化信号为3′UTR内的核苷酸序列，其导引聚腺苷酸化蛋白质复合物结合至信号序列内之AAUAAA序列。复合物含有：核酸内切酶，其在AAUAAA序列之下游约14至30个核苷酸处剪切mRNA；及聚合酶，其使一连串约100至200个腺嘌呤核苷酸(polyA尾)转录后合并至裂解之3′端。这种polyA尾影响mRNA代谢之许多方面，包括稳定性、转译效率及自细胞核至细胞质之转运。通常，聚腺苷酸化信号由侧接裂解及聚腺苷酸化位点的两个识别组件组成：位于裂解位点上游约14至30个核苷酸的高保守AAUAAA序列，及位于AAUAAA序列下游约20至50个核苷酸的低保守G/U富集区或U富集区。此等两个组件之间的裂解通常位于A残基之3′侧。在活体内，不同聚腺苷酸化位点之加工效率变化较大。聚腺苷酸化蛋白质复合物之组装速度为多级程序，且与聚腺苷酸化信号序列之强度相关。举例而言，因为组装速率更快，所以强SV40晚期聚腺苷酸化信号中发生裂解快于较弱SV40早期聚腺苷酸化信号(Chao等人，Molecular and Cellular Biology，第19卷(8)，5588-5600，1999)。

需要鉴别替代性强聚腺苷酸化信号或甚至极强之聚腺苷酸化信号以促进用于生产重组蛋白质之高生产细胞系的产生。使用强聚腺苷酸化信号或甚至极强之聚腺苷酸化信号可强化转录终止，从而增强经载体编码之mRNA、之生产、稳定性、核输出及/或翻译。此应产生较高量mRNA且因此可提高生产细胞之生产力。

发明概述

本文描述自中国仓鼠(灰仓鼠(Cricetus griseus))之生长激素所分离的新颖聚腺苷酸化信号。惊人地，已发现命名为HGH之此新鉴别聚腺苷酸化信号优于：BGH及SV40晚期强聚腺苷酸化信号。当使用包含HGH作为聚腺苷酸化信号序列之载体时，CHO-DG44细胞之瞬间转染中之蛋白质效价与包含BGH之细胞相比增加高达35％。在稳定细胞中，获得高达每天每个细胞45pg之高比生产力及补料分批培养中高达6.3g/L的效价。