[发明专利]蛋白筛选方法

说明书

相关申请

本申请要求2008年7月25日提交的美国临时申请第61/083813号、2008年8月19日提交的美国临时申请第61/090111号和2009年4月16日提交的美国临时申请第61/170029号的优先权，所述临时申请的内容通过引用并入本文。

背景

充分了解的是，在展示和选择技术的应用中，较高的多样性的获得容许更有效地选择具有最高亲和力、特异性、稳定性和/或其他期望特征的分子。

过去已开发的方法包括：噬菌体展示、核糖体展示、CIS展示和mRNA展示。最近，在使用体内筛选鉴定分子方面存在增加的兴趣(J Control Release.2003 Aug 28；91(1-2)：183-6)。使用噬菌体展示已使这种方法成为可能，但是这种方法具有噬菌体展示技术所提供的有限的多样性。由于RNA物质的不稳定性，核糖体展示或mRNA展示将无法用于这种应用。因此，DNA-蛋白融合体的开发由于该物质的增加的稳定性而将是高度期望的。

已经描述了三种类型的DNA-蛋白融合体。CIS展示是一种使用偶联的体外转录/翻译来在DNA被转录和翻译时产生与DNA共价结合的dsDNA结合蛋白的方法(PNAS，101(9)：2806-2810)。然而，该技术的主要局限之一是在转录/翻译过程中合成的蛋白可以与附近任何邻近的DNA结合，从而导致错误标记的融合体。第二种方法是Kurz和Lohse的方法(Chembiochem.2001年9月3日；2(9)：666-72)。此方法涉及使用多官能物质形成与mRNA的共价加成物，该多官能物质可以与翻译的蛋白共价键合，而在共价加成物处产生RNA上的核糖体停顿，并充当反转录的引物。这种方法的局限是使用补骨脂素与RNA的共价交联步骤是低效的。第三种方法是Yonezawa等人的方法(Nucleic Acids Res.2003年10月1日；31(19)：e118.)。在此方法中，将编码链霉抗生物素和多种肽的区域的DNA生物素化，置于具有翻译机制的合成微球中并进行翻译使得链霉抗生物素(四聚体)结合在生物素化的DNA上。这种方法的局限是所得物质是四聚体，这对于亲和力选择可能是麻烦的，因为在一个粒子上会有多种结合物质(再结合作用)。

本文描述一种用于产生需要的核酸蛋白融合体的简单有效的方法，该方法可以采用核酸与蛋白之间的非共价连接并且将容许DNA-蛋白融合体形成。

发明概述

本发明提供了选择和进化蛋白和核酸的期望特性的组合物和方法。在多个实施方案中，本发明包括与核酸或修饰的核酸连接的小分子。其他实施方案包括：制备多肽的方法，所述多肽包括具有修饰的氨基酸的肽；实现选择群体中具有期望特性的个别成员的测定；和用于产生具有改良特性的多肽的新变异的方法。

在一个方面，本发明提供异双功能复合体，所述异双功能复合体包含：

(a)第一核酸分子，所述第一核酸分子包含多肽编码序列；

(b)多肽，所述多肽由所述第一核酸分子编码；和

(c)第二核酸分子，所述第二核酸分子包含与所述第一核酸分子的部分互补的核酸序列，

其中所述第一核酸分子通过互补的核酸碱基配对与所述第二核酸分子结合，并且其中所述第二核酸分子与所述多肽非共价结合。

在一些实施方案中，这种异双功能复合体还包含：

(a)高亲和力配体，所述高亲和力配体与第二核酸分子共价结合；和

(b)配体受体，所述配体受体与肽受体结合，

其中所述高亲和力配体与所述配体受体结合并且所述肽受体与多肽共价结合。在一些实施方案中，这种异双功能复合体还包含第二高亲和力配体，其中所述第二高亲和力配体与肽受体共价结合，并且其中所述第二高亲和力配体与配体受体结合。在一些实施方案中，这种异双功能复合体中的肽受体通过连接物与第二高亲和力配体结合。在一个优选的实施方案中，连接物包括聚乙二醇。在另一优选的实施方案中，连接物还包括多聚唾液酸连接物。在一些实施方案中，这种异双功能复合体中的配体受体与肽受体共价结合。

在一些实施方案中，这种异双功能复合体还包含：

(a)配体受体，所述配体受体与第二核酸分子共价结合；和

(b)高亲和力配体，所述高亲和力配体与肽受体结合，

其中所述配体受体与所述高亲和力配体结合并且所述肽受体与多肽的C端共价结合。