[发明专利]人儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)测定

说明书

发明背景

COMT为存在于人体许多组织中的酶。其主要功能为使起激素和神经递质作用的肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺(儿茶酚胺)失活，从而促进从身体移除这些物质。本发明人以前已表明该酶的细胞水平由雌激素——雌二醇调节。许多化学物质(人造的和天然存在的)都可模拟或抑制雌二醇的作用。如果进入人体，这样的化学物质可导致对雌二醇正常作用的干扰，并在人生命的各个阶段都引起健康问题。这些化学物质以及影响其它激素作用和新陈代谢的其它化学物质统称为内分泌干扰物。影响雌二醇作用的化学物质很可能是内分泌干扰物中最重要的一类。它们与西方男性的精子数下降以及常见癌症例如乳腺癌和卵巢癌的成因有关。

本发明人已表明，多氯联苯(PCB；公认对人类健康和较大范围的环境具有极其严重的威胁)和各种增塑剂及相关化学物质能够调节COMT蛋白表达水平。这些化学物质都不与雌二醇密切相关，但它们都通过与雌二醇相同的机理调节COMT水平(Ho等，2008a，b)。因而，测定暴露于这样的化学物质的细胞中的COMT蛋白是对该化学物质雌激素活性的一种衡量。从未对存在于或者可能被引入环境中的大量化学物质评估过它们干扰内分泌的雌激素潜能。这是因为作为公认的内分泌干扰试验的二代大鼠试验很耗时间且非常昂贵。欧盟颁布的法规指出存在大约30,000种必须检验的化学物质。如上所述，COMT蛋白测定可能提供干扰雌激素内分泌潜能的衡量。测定COMT蛋白的现有方法慢、工作量大，且受限于样品处理能力。例如，目前人COMT蛋白浓度的测定通过使用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)/蛋白质印迹测定法实现。SDS-PAGE涉及使用包含丙烯酰胺和双丙烯酰胺(它们为神经毒的)以及十二烷基硫酸钠(它为肺刺激物和致敏物)的缓冲液和凝胶。尽管许多实验室使用商用预制凝胶和制备好的缓冲液，以使工作人员暴露于这些化学物质的程度最小，但是它们存在于实验室环境内，并且需要执行合适的安全规程以确保安全操作和处理。SDS-PAGE/蛋白质印迹法耗时、繁琐、难以准确定量、相对受限于其处理样品的能力，因而也是高成本的。

评估COMT浓度的备选方法为测定COMT活性并推断结果。这涉及利用所述酶的放射性底物，以及伴随它们的附带危险和处理污染物的难题。因此，需要一种简单、廉价并可处理很多样品的COMT测定法。下文所述测定法克服了这些难题，因为其易于使用、廉价并具有高样品处理能力。因此，其特别适合作为潜在雌激素内分泌干扰物的初始筛选系统。

发明简述

本发明提供用于测定生物培养物、生物组织、生物液体和环境样品中COMT蛋白水平的简单、准确、廉价且快速的方法。

本发明的其它方面为新型抗体、多肽和多核苷酸。在另外的方面，本发明提供包含可用于测定的材料的试剂盒。

附图简述

图1描述新型表位(NE)构建体的线性结构。

图2阐述COMT测定的实施方案可如何进行。

图3显示COMT测定的实施方案如何运作。该测定中的颜色强度与标准样品和未知浓度样品中的COMT浓度成反比。

图4提供新型表位(NE)的预测二级结构。

图5显示通过抗-NE抗体和抗-COMT抗体检测HEK293细胞中的重组MB-COMT-NE蛋白。

图6显示通过抗-NE抗体和抗-COMT抗体免疫沉淀(IP)和检测HEK293细胞中重组MB-COMT-NE蛋白的结果。

图7显示大肠杆菌中的重组MB-COMT-NE蛋白的考马斯蓝蛋白染色。

图8显示通过抗-NE抗体、抗-COMT抗体和抗-GST抗体检测重组GST-MB-COMT-NE蛋白。

图9显示测定抗-NE抗体亲和结合至修饰NE表位的斑点印迹测定结果。还显示了保守(类别内)氨基酸取代的实例的表格，可进行所述取代以产生潜在具有基本相同抗原特性(例如结合抗-NE-表位)的其它NE-表位变体。

图10显示在MCF-7细胞裂解物中的COMT竞争性ELISA测定的实例。

图11显示COMT EIA试剂盒的标准曲线的实例。

序列简述

SEQ ID NO：1为18个氨基酸的新型表位(NE)。

SEQ ID NO：2为用于含BamHI限制位点的人S-COMT cDNA的正向引物。

SEQ ID NO：3为用于含BamHI限制位点的人MB-COMT cDNA的正向引物。

SEQ ID NO：4为用于编码NE序列和EcoRI限制位点的S-COMT和MB-COMT的反向引物。