[发明专利]细菌的[2Fe-2S]二羟酸脱水酶的鉴定和用途

说明书

相关申请的交叉引用

本专利申请涉及并要求2008年9月29日提交的美国临时申请61/100,792的优先权，该专利全文以引用方式并入本文。

发明领域

本发明涉及工业微生物学领域和二羟酸脱水酶活性的表达。更具体地讲，鉴定了具有[2Fe-2S]簇的细菌二羟酸脱水酶，并使其在细菌和酵母宿主中作为异源蛋白质被表达。

背景技术

二羟酸脱水酶(DHAD)，也叫乙酰羟酸脱水酶，催化2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸和2，3-二羟基甲基戊酸转化为α-异亮氨酸酮酸。被分类为E.C.4.2.1.9的DHAD酶是天然存在的生产缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和泛酸(维生素B5)的生物合成途径的部分。对于增强的支链氨基酸或泛酸的微生物生产，活性DHAD的提高的表达是合乎期望的。

2，3-二羟基异戊酸向α-酮异戊酸的DHAD催化的转化也是共同拥有和共同未决的美国专利申请公布US 20070092957 A1中所公开的多种异丁醇生物合成途径的共同步骤。本文公开的是用于生产异丁醇的重组微生物的改造。异丁醇作燃料添加剂是有用的，其可用性可减少对石油化学燃料的需求。

为了提高在包括了二羟酸脱水酶的途径中合成的化合物的生产，在所关注的生产宿主中表达提供这种酶活性的异源酶是合乎期望的。由于这种酶需要Fe-S簇，而这种需求涉及Fe-S簇的可获得性和其向DHAD脱辅基蛋白中的正确装载，二羟酸脱水酶在异源宿主中功能性的高表达的获得是复杂的。

需要Fe-S簇的DHAD是本领域已知的，并且被发现以[4Fe-4S]或[2Fe-2S]形式存在。一些细菌的此类酶是已知的，其中被最好地表征的是来自大肠杆菌的(E.coli)(Flint，DH，等人(1993)J.Biol.Chem.268：14732-14742)。然而，这些细菌的酶均为[4Fe-4S]形式。迄今报道的惟一[2Fe-2S]形式是一种菠菜酶(Flint和Emptage(1988)J.Biol.Chem.263：3558-3564)。

由于[2Fe-2S]形式在Fe-S簇的合成和/或组装方面造成的负担更小，在宿主细胞中使用[2Fe-2S]形式的这种酶以提高所引入的生物合成途径的生产是合乎期望的。遗憾的是，这种酶仅有一种[2Fe-2S]形式是已知的。

因此，存在对鉴定DHAD的新的[2Fe-2S]形式以用于重组宿主细胞中的需求，其中所述重组宿主细胞中，2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸是所期望的生物合成途径中的代谢途径步骤。

发明概述

本文提供了鉴定[2Fe-2S]DHAD酶的方法，所述方法包括：

a)用序型隐蔽马尔科夫模型(Profile Hidden Markov Model)查询一种或多种氨基酸序列，所述序型隐蔽马尔科夫模型是使用SEQ ID NO：164、168、230、232、298、310、344和346的蛋白质制备的，其中具有小于10^-5的E值的匹配提供了第一序列子集，从而所述第一序列子集对应于一种或多种DHAD相关蛋白质；

b)分析步骤(a)的对应于一种或多种DHAD相关蛋白质的第一序列子集中三个保守的半胱氨酸的存在，从而鉴定出编码[2Fe-2S]DHAD酶的第二序列子集，其中所述三个保守的半胱氨酸对应于变异链球菌(Streptococcus mutans)二羟酸脱水酶氨基酸序列(SEQ ID NO：168)的56、129和201位；以及

c)分析步骤(b)的第二序列子集中特征保守氨基酸的存在，从而进一步鉴定出编码[2Fe-2S]DHAD酶的第三序列子集，其中所述特征保守氨基酸的位置对应于变异链球菌DHAD氨基酸序列(SEQ ID NO：168)中的以下位置：88位的天冬氨酸、142位的精氨酸或天冬酰胺、208位的天冬酰胺和454位的亮氨酸。

在本发明的另一方面，上述方法进一步包括：

d)在细胞中表达具有可通过步骤a)、b)和c)中任何一个或全部步骤鉴定的序列的多肽；以及

e)确认所述多肽在细胞中具有DHAD活性。

在本发明的另一方面，上述方法进一步包括：

d)纯化由可通过步骤a)、b)和c)中任何一个或全部鉴定的序列编码的蛋白质；以及

e)通过紫外可见(UV-vis)和电子顺磁共振(EPR)光谱法确认所述蛋白质是[2Fe-2S]DHAD酶。