[发明专利]用于在富含二氧化碳的空气供应下在液体培养基中生产胸膜炎肺炎放线杆菌毒素APXI或APCIII的过程

说明书

本发明涉及通过在液体培养基中培养胸膜炎肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)生产RTX-毒素ApxI或ApxIII的方法。

猪胸膜肺炎，猪中的主要呼吸性疾病，在全世界传播，并且由于过急性死亡、急性病猪的治疗和慢性感染动物销售中的延迟，引起养猪业的重大经济损失。病原体是胸膜炎肺炎放线杆菌。它主要通过动物间的直接接触传染，并且所得到的感染产生从过急性到慢性不等的临床过程。该疾病主要是呼吸道感染，具有高热、严重呼吸性窘迫、咳嗽和厌食的临床体征。该疾病的发作是快速的，并且发病率和死亡率很高。控制胸膜炎肺炎放线杆菌(从现在开始也称为“APP”)感染的方法之一是通过疫苗接种程序。菌苗在过去已用于此类程序中，但因其严重副作用而众所周知。现今基于APP毒素的亚单位疫苗是常用的。

APP产生所谓的RTX-毒素(RTX代表重复子毒素(repeat-in-toxin))。正是这些RTX-毒素的存在高度促成这种细菌的致病性特征。RTX-毒素已在过去得到广泛综述，并且在文献中得到描述。如通常已知的，并非所有APP血清型都产生所有RTX-毒素。例如，血清型1、5、9和11产生ApxI和ApxII。血清型2、3、4、6和8产生ApxII和ApxIII。血清型10仅产生ApxI，并且血清型7和12仅产生ApxII。针对APP的目前商购可得疫苗基于毒素ApxI、ApxII和ApxIII。最近以来已发现所有APP血清型都产生第4种RTX毒素，目前称为ApxIV(参见EP 0 875 574)。

目前已知如何通过在液体培养基中培养胸膜炎肺炎放线杆菌来生产RTX-毒素ApxI或ApxIII。特别地，EP 0 453 024已描述了生产ApxI的方法(参见“Example 2”，段落2“Purification andcharacterisation of hemolysin”，子段落“Methods”)和ApxIII(参见“实施例4”，段落2“Purification and characterisationof App macrophage toxin(Mat)”，子段落“Methods”)。应当指出ApxI习惯被称为“HLY”，而ApxIII通常被称为“Mat”(参见Frey等人在″J Gen Microbiol.1993 Aug；139(8)：1723-8″中)。培养基必须支持APP细菌的生长。通常已知如何构成支持细菌生长的培养基。标准培养基最初由Eagle，Ham及其他人在20世纪50年代和60年代开发。他们发现满足生长的基本需要的培养基应包括无机盐、氮源(例如以含氮化合物的形式，例如肽或蛋白质)、碳源和维生素。培养基有利地进行缓冲以阻止其变得太酸或太碱。在这个基本配方内，许多不同构成是可获得的。例如，可以选择动物衍生的组分以提供氨基酸，但也可以选择化学成分限定的氨基酸。对于其他化合物，众多变化也是可能的。事实上，构成支持细菌生长的培养基是相对简单的。然而，生长和/或代谢产物生产的最佳化可以花费一定的开发时间，特别是当不含血清或其他动物衍生的组分的培养基是优选的时。然而，用于改善发酵培养基性能的策略是本领域通常已知的，并且在文献中得到充分描述(参见例如由Kennedy和Krouse在Journal ofIndustrial Microbiology & Biotechnology(1999)23，456-475中的综述文章)。此类最佳化构成发酵实验室内的常规实验部分。在APP培养的情况下，NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)固有地构成培养基的部分，因为APP是NAD依赖性的。如果没有NAD，那么培养基将不支持胸膜炎肺炎放线杆菌细菌生长，并且因此不能被视为在本申请和附加权利要求含义中用于支持APP生长的液体培养基。用于支持细菌生长的液体培养基，或构成此类培养基的组分，可从各个公司商购得到，例如Sigma Aldrich、Quest International、Oxoid、Becton Dickinson、Pharmacia、VGD Inc、Mediatech、Invitrogen、Marcor、IrvinScientific等。