[发明专利]用于抗微生物应用的肽序列、其分枝形式以及其用途

说明书

发明领域

本发明涉及有效的抗微生物肽序列的鉴定，特别是抗蛋白酶活性并因此非常适合于在体内使用的抗微生物肽序列的鉴定，特别是当以四分枝MAP形式合成时。本发明的序列(KKIRVRLSA，SEQ ID No.1，RRIRVRLSA，SEQ ID No.2，KRIRVRLSA，SEQ ID No.3，RKIRVRLSA，SEQ ID No.4)来源于以前报道的以谷氨酰胺作为第一个氨基末端残基的肽M6。去除谷氨酰胺给予了肽稳定性和批次与批次之间均一性预料之外的且令人惊奇的改善，并因此提供了肽合成的可靠方法，其对于M6肽是特别困难的。

技术背景

多药物抗性细菌的不断出现是全球关注的事情，这些国家中的大部分都将抗生素广泛地使用于临床。许多病原体如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、一些肠球菌(enterococci)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和许多其他革兰氏阴性细菌都已经产生了对大多数常规抗生素以及对那些新一代抗生素的抗性(Wenzel和Edmond 2000)。因此，研发新的抗生素变得越来越重要。这种需求促使研究团体和药物公司考虑新的抗微生物剂。抗微生物肽被认为是对通常引起抗性细菌选择的常规抗生素的最佳替代物之一(Hancock和Sahl 2006)。大多数抗微细菌是动物包括人类、植物和真菌的天然免疫组分(Zasloff，2002)。它们通常由6-50个氨基酸残基组成，并具有净正电荷。阳离子肽选择性地与阴离子细菌膜和与其他负电荷结构例如LPS和DNA相互作用。真核细胞的膜的外层通常比细菌的膜的外层带更少的负电荷，并且与细菌的膜不同，它们也通过胆固醇分子稳定化。这些差异是阳离子肽的特异性的基础。因此，阳离子抗微生物肽的作用机制归因于它们与细菌膜的特异结合，其引起细胞通透，并且在某些情况下引起代谢途径抑制。

因而，许多研究旨在通过研究它们的作用机制、当局部地或者全身地施用时它们对真核细胞的毒性和它们的治疗有效性来鉴定和表征抗微生物肽序列。遗憾地是，迄今为止，两个主要的问题阻碍了抗微生物肽药物的研发。第一个问题是用于细菌的天然抗微生物肽的选择性通常太低并且它们对真核细胞特别是红细胞有剧毒，产生了高水平的溶血。第二个问题与肽在体内普遍的短半衰期有关。这是过去10年仅有很少的阳离子肽进入市场的主要原因(多粘菌素和达托霉素是两个成功的例子)。

几年前，研究者开始致力于鉴定在实验室中通过合理设计或者组合文库的筛选而选择的非天然来源的新肽序列。目的是根据一般毒性和对细菌的特异性以及改进的半衰期为药物研发发现具有更好的生物学特性的肽。

在本发明人的实验室中，鉴定了非天然肽序列，其特别地显示出对革兰氏阴性细菌强的抗微生物活性(Pini等，2005)。通过合理地修饰鉴定自组合文库的序列获得了肽(QKKIRVRLSA，SEQ ID No.5，称为M6)，其以MAP四分枝形式合成，其中4个相同的肽序列通过赖氨酸核心连接到一起。这种分子显示出对蛋白酶和肽酶高的抗性，因而克服了短半衰期的问题(Bracci等，2003；Falciani等，2007)。已经在以下方面对分枝状的抗微生物肽M6进行了表征：其对许多细菌包括几种多药物抗性临床分离物的生物学活性，其与DNA的相互作用，其对几种真核细胞系的体外毒性，以及其溶血活性，其免疫原性，当腹膜内或静脉内注射时其在体内的毒性(Pini等，2007)。

在M6的表征中进行的所有实验期间，我们注意到具有非均一的活性的M6产生的肽的不同合成(批次与批次之间不同)(图1A)。质谱分析显示，M6的第一个氨基酸，即谷氨酰胺，转变成了焦谷氨酸(图1B)。含有焦谷氨酸而非谷氨酰胺的不同的肽的存在以不可预测的百分率随批次而改变。事实上，完全去除这种副产物是不可能的，首先，因为在HPLC纯化期间由于其与主要产物具有类似的保留时间而不容易除去它，第二，因为当在溶液中时，它会持续从亲代肽中产生。由于焦谷氨酸类似物相对于谷氨酰胺类似物显示出明显降低的抗微生物活性，所以混合物的整体活性因批次而异(图1A)。