[发明专利]控制哺乳动物细胞培养过程中pH值、重量克分子渗透压浓度和溶解二氧化碳水平来增强细胞生存力和生物产物产量的方法

说明书

发明领域

本发明涉及哺乳动物细胞培养过程，更特别地涉及通过改善细胞培养基的过程参数，包括pH值、重量克分子渗透压浓度和溶解二氧化碳水平的控制来增强细胞生长、细胞密度、细胞生存力、产物浓度和产物产量的方法。

背景

蛋白质治疗剂和其他生物制品例如单克隆抗体的商业性生产当前一般在生物反应器中进行，所述生物反应器适合于培养遗传优化的哺乳动物、昆虫或其他细胞类型的悬浮液。哺乳动物细胞培养生物反应器一般具有数百到数千升工作体积。最常见的全规模制造厂具有工作体积从约1,000升直到25,000升的工作体积的生物反应器。临床试验的药物候选物在具有五（5）到几百升工作体积的实验室规模生物反应器中生产。

优化以实现最少的时间量中可能的最高生物产物产量和生物反应器规模扩大的相关的挑战集中于控制公认的关键过程参数，例如pH值、溶解氧（DO）、温度、营养物组成和副产物分布、搅动分布、气体喷射方法、营养物进料和产物收获分布。其他过程参数例如溶解的二氧化碳（dCO₂）和重量克分子渗透压浓度（即，每千克溶液溶解的颗粒的浓度）的重要性近来才被记录在文献中。事实上，许多商业的生物反应器甚至不具有安装的装置来就地测量溶解的二氧化碳水平和/或重量克分子渗透压浓度，不用说控制和优化这些参数的装置。取决于商业性运行的规模——从数百直到25,000升的生物反应器体积，过程的规模扩大、优化和控制构成了不同的挑战。在高于约1,000升的商业规模下，如果可能的话，使用当前最好的可获得的技术和方法，溶解的二氧化碳水平和重量克分子渗透压浓度的同时和单独控制变得困难。

在生物反应器中开始制造规模的哺乳动物细胞培养过程之前，一般制备种子培养物接种物。这涉及在孵化器中的一系列烧瓶和/或递增体积的较小生物反应器中培养生产细胞，直到可获得足够的细胞用于接种到生产生物反应器中。所述过程涉及将细胞群体从一个培养容器转移到更大的培养容器中。一般地，细胞群体的20%稀释物被用于每次转移或传代培养。在孵化器中，具有培养基的烧瓶被夹持在转台上来漩涡培养物和促进培养基与孵化器中的大气之间的气体转移. 一般地，用于哺乳动物细胞培养过程的孵化器设置在37℃、5%二氧化碳（CO₂）和高于约80%的湿度水平。类似的温度和CO₂水平用于在生物反应器中生长的种子培养物。当种子培养物达到足够的体积和细胞密度时，它被接种到生产生物反应器中。

在种子培养物接种到生物反应器培养基中之后，在细胞培养过程期间，参数例如pH值、温度和溶解氧水平被控制到指定的水平。pH值一般通过在过程期间必要时添加碱性或酸性溶液来控制。通常使用的碱性溶液包括碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化钠溶液。二氧化碳（CO₂）的溶解通常用于实现更为酸性的pH值。虽然可以获得其他酸用于控制pH值，溶解的CO₂和碳酸氢钠组合形成了细胞培养物的最稳定的和有利的缓冲系统。哺乳动物细胞培养过程的培养基或溶液的优选的温度是约37℃。培养基或溶液中期望的溶解氧水平一般利用安装在生物反应器底部的喷射器通过空气喷射来实现，以及利用分解大的空气/氧气泡的叶轮搅动培养基或溶液来增强氧气从喷射的气泡向细胞培养基的转移。用覆盖气体吹扫生物反应器顶部空间提供了有限程度的表面气体交换。不利地，空气喷射和培养基或溶液的搅动可能引起泡沫和对哺乳动物细胞的剪切损伤，其不利地影响细胞生存力。在培养基的表面上泡沫的积累也导致进一步限制表面气体交换和降低生物反应器的可用的工作体积。

商业规模的哺乳动物细胞培养过程可以以三种不同的运行方式进行：用于悬浮的细胞培养物的批量模式和进料-分批模式，以及用于固定化细胞的灌流模式。大部分商业规模的哺乳动物细胞培养过程以进料-分批模式运行。在进料-分批模式中，其他的培养基和营养物在细胞培养过程期间的不同时间添加到生物反应器，来在初始的生物反应器建立之后补充碳源和其他营养物。