[发明专利]用于检测和/或鉴定军团菌属细菌的反应培养基

说明书

本发明涉及用于军团菌的反应培养基，还涉及此培养基的用途以及使用这种培养基的方法。

军团菌(Legionella sp)是水生环境(自然生态系统和水分配网)的细菌，能够在人类中引起感染，有时是致死的感染。在人类中已经证实了军团菌属的数个种，但最重要的是嗜肺军团菌(L.pneumophila)，其是大约90％军团菌病病例的成因。其他种，诸如约旦军团菌(L.jordanis)，通常从免疫抑制个体中分离。军团菌病(或军团病(legionnaire′s disease))是呼吸疾病，其特征为严重急性肺病，其感染是通过吸入受军团菌污染的气悬体而获得，例如冷却塔、空调系统，保健水疗(health spas)、淋浴等。在2到10天的潜伏期后，患者表现出流感样综合征。这之后是高烧、胸膜炎(pleuresy)和严重的咳嗽，伴有胃肠问题(腹泻、呕吐)或甚至有时是神经学上的问题(谵妄、嗜睡、精神错乱)。在2005年，法国报道了超过1500个病例，而欧洲报道了大约5700个病例；在美国，CDC(Centers for Disease Control and Prevention)估计每年有8000到18,000个军团菌病的病例。

军团菌病的诊断非常复杂，因为该疾病是非典型的：标准的肺病，其没有任何特别。平均起来病例的死亡率是20％，在社区病例中较低，但另一方面，在医院病例中很高。早期诊断是非常重要的，以便为患者提供合适的治疗。

可以根据下列方法进行诊断：

-通过直接免疫荧光法的鉴定。用抗主要嗜肺军团菌血清组(serogroup)的抗体在样品上进行，此方法能够证实可溶性抗原。主要使用的方法是ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫学测定)或ICM(膜上的免疫色谱法)。这些技术的主要缺点是它们只能检测某些嗜肺军团菌血清组的可能存在；

-通过间接免疫荧光法对于抗LPS O抗原的抗体的血清学诊断。此方法只能鉴定嗜肺军团菌血清组1，并且有很多假阳性的风险，这是由于和分枝杆菌(mycobacteria)、钩端螺旋体(leptospira)、衣原体(Chlamydia)、支原体(Mycoplasma)、假单胞菌(Pseudomonas)、黄杆菌(Flavobacterium)等的交叉反应；

-通过培养法的细菌学鉴定。培养军团菌是很难的。这是因为它们不在血液琼脂上生长，必须严格控制pH(6.9+/-0.2)，并且必需满足细菌的要求。因此，培养通常在添加了ACES缓冲液、L-半胱氨酸和铁(后两种成分是必需生长因子)的BCYE(Buffered Charcoal Yeast Extract)琼脂，或者GVPC琼脂上生长。可在37℃温育48小时后观察到菌落。军团菌的鉴定可以在GVPC军团菌培养基(bioMérieux)上进行，其是促进大部分军团菌种(尤其是嗜肺军团菌)的分离的特异性和选择性培养基。依靠经优化的3种抗生素的混合物，此培养基能够抑制革兰氏阳性菌、大部分革兰氏阴性菌、酵母和霉菌的生长。

但是，现有的培养基含有活性碳，以便吸附军团菌产生的有毒化合物、或培养基中存在的有毒化合物(酵母提取物，琼脂，等等)、或通过培养基的高压灭菌(其造成自由基的形成，这对军团菌也是有毒的)产生的有毒化合物。这些培养基因此是黑色的，这使它们不适合掺入生色或荧光酶底物，而这类底物能够促进培养基的解读。

本发明目的是通过提供新的用于军团菌属细菌的反应培养基以解决现有技术中的问题。

出人意料的，本发明人证明硅质化合物在反应培养基中的使用允许快速和方便的检测军团菌。

在介绍本发明之前，给出下列定义以便更好的理解本发明。它们决不是为了进行限制。

术语反应培养基旨在表示包含代谢的表达和/或微生物(诸如军团菌)的生长必需的所有成分的培养基。

反应培养基可以是固体、半固体或液体。术语“固体培养基”旨在表示，例如胶凝的(gelled)培养基。琼脂是微生物学中用于培养微生物的常规胶凝剂，但有可能使用结冷胶(gelrite)、明胶、琼脂糖或其他天然或人工的胶凝剂。本发明的反应培养基必须允许军团菌的生长。

反应培养基可以包括组合在一起的一种或多种成分，诸如氨基酸、碳水化合物、核苷酸、矿物质、维生素等。

培养基还可以包含着色剂。为了说明着色剂，可以提及的包括伊文思蓝、中性红、遮光剂如二氧化钛、硝基苯胺、孔雀绿、亮绿、一种或多种代谢指示剂、一种或更多种代谢调节剂，等等。