[发明专利]植物中氮应答的改进

说明书

发明领域

本发明通常涉及分子生物学领域。

发明背景

在生长的谷物中，氮(N)肥料构成单独的最昂贵的投入。改进杂交种对N的应答不但将增加农民的利润率，而且帮助减轻流掉的或沥滤掉的硝酸盐对环境的不利影响。

玉米根以硝酸盐的形式从土壤中吸收大部分N，所述N除了在根中被较小程度地同化为氨基酸之外，其被运送至叶用于还原和同化(Crawford and Glass，(1998)Trends in Plant Science 3：389-395)。

根细胞中的硝酸盐流入伴随流出，这是有利的，因为细胞内部是带负电荷的，并且作为阴离子的硝酸盐被吸收是逆电化学梯度的。随着细胞内部硝酸盐浓度的增加，流出显著增高，占吸收的总硝酸盐高达30％(Volk，(1997)Plant Science 123：1-7)。这提示了硝酸盐从根的流失构成N利用的瓶颈。硝酸盐的摄入是主动(需要能量)过程：将每个硝酸盐离子吸收进细胞需要水解两个ATP分子。以过度流出的形式所浪费的能量反而可能用于提高生产率。为了从土壤中持续摄入硝酸盐，必需通过还原和同化为氨基酸然后是蛋白，耗尽细胞中的硝酸盐池，这大多数发生在叶中。

诸如玉米的作物植物中先存的新陈代谢体系可能不易于为改进的N利用的操纵做准备。例如，多胺，天然存在的富含N的化合物在植物细胞中无处不在，且已知在植物细胞暴露于胁迫后，马上就有它们的积累(Galston and Sawhney，(1990)Plant Physiology 94：406-410)。

还认为多胺在植物生理应答和形态发生中具有数种信号转导作用。诸如酰脲的富含N的嘌呤衍生物是从共生的豆科植物类的根瘤处N固定和运送的优选来源(Smith and Atkins(2002)Plant Physiology 128：793-802)。形成这些化合物的植物酶还参与无数核苷酸类型以及植物激素的合成。尽管有高的C∶N比，但是由于酰脲必须转换为用于再同化的铵和二氧化碳，所以酰脲构成移位的N的比较浪费的来源。

引入用于N利用的不同于先存新陈代谢体系的新机制提供了改进植物中N利用效率的吸引力的目标。表达了关于植物中冠瘿碱合成和分解的基因，并评价它们对N利用效率的影响。氨基酸-酮酸轭合物——冠瘿碱提供了移位N而不浪费任何能量的新方式，因为产生它们所使用的NADH由于它们的分解而再生。

本发明详细公开了工程化植物的方法，所述方法产生诸如改进N利用效率的冠瘿碱的小的富含氮的化合物，且随后利用所述化合物用于产量形成。冠瘿碱是由诸如农杆菌(agrobacterium)的一些肿瘤发生细菌类感染的植物细胞产生的独特的分子种类(Tempe and Goldmann，(1982)″Occurrence and biosynthesis of opines(冠瘿碱的发生和生物合成)″In Kahl G.and Schell J.，eds)Molecular Biology of Plant Tumors.(Academic Press)，New York，pp.427-449)。携带T-DNA的农杆菌将编码冠瘿碱合成酶的基因转移进植物基因组中，其中这些基因的表达导致冠瘿碱的合成。存在于非转移质粒(部分)上的分解冠瘿碱的酶在细菌细胞自身中表达，使这些细菌可以利用这些分子作为它们生长的C源和N源(Tempe and Petit，(1982)″Opine utilization by Agrobacterium(农杆菌的冠瘿碱利用)″；In Kahl G.and Schell J.，eds)Molecular Biology of Plant Tumors.(Academic Press)，New York，pp.451-459)。与一些其他富含N的化合物不同，冠瘿碱用于N从一个植物器官移位至其他植物器官中是理想的，因为它们保存了它们合成所消耗的所有能量并由于它们的分解而释放所述能量。

尽管已知天然存在各种各样的冠瘿碱分子，但是用于本方法中的最感兴趣的冠瘿碱是含有高浓度N的冠瘿碱。由于两种类型——章鱼碱和胭脂碱是由富含N的氨基酸制成，因此它们最适合用于我们所提出的工作中(Winans，1992)。

冠瘿碱形成基因的表达导致植物细胞中隔离附加的N，从而通过产生更有利于硝酸盐持续吸收的电化电势，降低从根回流至土壤的硝酸盐流出。由于一旦产生，植物细胞不能代谢这些化合物，通过表达冠瘿碱分解酶，可以在选择的组织或细胞中指定它们的利用。