[发明专利]通过实时聚合酶链反应的核酸分析方法及实施该方法的装置

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学、医学、生物技术，并涉及进行聚合酶链反应(PCR)和利用反应产物累积的实时记录(实时PCR，rt-PCR)来实施的装置。所提出的方法和装置可用于医学、兽医和食品加工，用于环境研究和与检测、鉴定和定量评估所研究的样品中的核酸有关的其他领域。

PCR表示由反应混合物的温度的循环变化所引起的特定DNA片段的合成的多次重复循环(扩增)，结果使得被两个寡核苷酸引物限定的DNA片段的数量呈指数级增长。本领域技术人员称作热循环的反应混合物温度的循环变化通过以下连续阶段而进行：使双链靶DNA分子变性(熔解)、使寡核苷酸引物连接到所形成的单链靶DNA分子的互补位点(退火)，和在热稳定性聚合酶参与下使引物延长，直至形成互补DNA分子的延长片段(延伸)。执行这些阶段的条件对于本领域技术人员而言是公知的。

PCR用于扩增核酸，并可利用DNA/RNA样品中的靶核苷酸序列检测和鉴定核苷酸的存在和数量。

PCR实验包括制备在缓冲液中的反应混合物，其一般含有热稳定性聚合酶、三磷酸脱氧核苷、寡核苷酸引物和镁离子。将所研究的DNA样品添加至该混合物中以进一步扩增，随后对扩增的核苷酸序列(扩增子)进行记录。

为对反应结果进行实时记录，在荧光插入染料或荧光标记引物或探针存在下，利用配备有荧光检测器的热循环仪进行该反应。

术语和定义：

物体的蓄热量(thermal mass)(J/K)等于制得其的材料的热容量乘以其质量，其表征所研究的物体在供给或除去热能时改变其温度的能力。含有由不同材料制得的多个部分的复合物体的总蓄热量等于其所有部分的蓄热量的总和。

材料的导热系数(W/m*K)表征材料传导热能的能力。

物体的导热率(W/K)的等于制得其的材料的导热系数与热交换表面积的乘积除以材料厚度，其表征物体通过热交换表面传导热能的能力。

热扩散系数(m²/s)等于材料导热率与其热容量和其密度的乘积之比，其表征与材料自身的热积蓄过程相关的材料与周围介质热交换的能力。

包含两个物体(加热或冷却第一物体，通过第二物体交换热量)的系统具有以下特征。第一物体的蓄热量与第二物体的导热率之比(以秒表示)表征系统通过第二物体向第一物体迅速供给热量的能力和通过第二物体从第一物体除去热量的能力。

背景技术

利用市售设备的现有PCR方法通常基于利用安装在金属加热块中的聚合物管。高蓄热量的标准加热块中安装有管和样品，管壁的低导热率限制了样品的加热和冷却速率，并可导致管中样品上的温度高度不一致。

当使用用于聚合物管或盘中的PCR的常用实验室装置时，热循环过程中保持温度的推荐时间为2分钟以上。例如，Ausubel等编辑的(1996)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols (Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley &Sons，Inc.)推荐除去温度转变时间，每个循环采用5分钟的持续时间。结果，由40次热循环构成的PCR分析在使用样品体积为20μL～50μL的典型PCR设备时需耗时3个小时以上才能完成。

为减少单次循环所花费的时间，近来已经提出了许多在微型反应容器中进行PCR分析的方法。为增加温度转变所需时间，所述装置中的加热元件的质量、容器的质量和样品的体积被大幅降低，这使蓄热量降低、可使用具有高导热系数且样品表面积与其体积之比较高的材料。也可以将向样品非接触式供热的方法用于加热。例如，RapidCycler(Idaho Technologies Inc.，USA)可实现在温度转变过程中PCR混合物温度的较快改变，并可确保由加热器至样品的比较有效的热传递。在该装置中，rt-PCR的30次循环可以在10分钟内完成。

还有在可缩短单次循环所需的时间的微流装置中实施的方法。例如，Kopp等在(1998)Science，280：1046中描述了一种装置，其中PCR混合物通过微流芯片中迂回形式的微通道连续流过3个温度区域，在20次热循环过程中引起PCR温度的循环改变。由于微通道的截面较小，因此微通道内溶液的温度变得特别快。混合物处于某一温度的时间在此情况下通过流速来调整。作者证明了PCR在所述装置中循环时间为6.6秒的可能性。

因此，微芯片技术的应用使得PCR循环时间显著缩短，这引起总PCR分析时间的缩短和处理能力的提高。