[发明专利]利用单倍切割确定单倍型的方法

说明书

相关申请

本申请要求于2008年10月21日提交的美国临时专利申请系列第61/136,992号的优先权，通过引用将该临时申请的全部内容并入本文。

发明领域

本发明通常涉及遗传学、分子细胞生物学领域，更具体而言，本发明涉及单倍型确定的方法。

发明背景

正常人体体细胞是二倍体(即，具有两个拷贝的基因组：每个细胞核中有一套父本染色体和一套母本染色体)。每个个体中，这两套染色体在多个基因座处具有不同的核苷酸序列(单核苷酸多态性(SNP))。传统的基因型分型测定分析这两套染色体的混合物，这导致不确定性和复杂性。例如，对于都是杂合的任意两个SNP基因座，这两个SNP之间具有四种可能的单倍型。然而，由于当用传统平台进行单个SNP基因型分型时，消除了相信息，因此不能排除这四种可能单倍型中的任何一种可能。解决该问题的一种方法是寻找重建或收回相信息的可靠的方法。另一种方法是在进行基因型分型之前提取相信息。

本领域技术人员使用各种统计学算法来重建相信息。这些算法包括Clark算法、期望最大化(EM)算法、基于联合的算法(pseudo-Gibbs取样器和完美/非完美的系统发生)以及由完全的贝叶斯模型(单倍型)或由EM(PLEM)实施的分区-连接算法(Liu N，et al.，Advances in Genetics，60：325-405，2008)。基于非定相的基因型数据统计的单倍型构型通常给出大量不确定的单倍型，这显著降低了其在遗传学应用中的能力。此外，对于是否应当将构建的单倍型看成这些研究中基因型和表现型的客观观察数据，仍存在争议。尽管来自家庭成员的基因型通常能帮助确定单倍型，但由家庭数据所推断的单倍型常受缺少信息价值的数据或数据缺失的限制。此外，对大多数常见的人类疾病的晚期侵袭可以排除从前几代收集DNA样品。因此，这些方法不适于未来个性化用药中的分子诊断。

平行地，一些研究者开发了在基因型分型之前提取基因组DNA样品中的相信息的实验方法。这些方法全部都基于基因型分型之前两条同源基因组DNA的物理分离。挑战在于如何分离二倍体细胞中两个几乎相同的染色体拷贝。已经开发出了将二倍体样品分离为其单倍体组分的数种策略/技术，例如，1)长距离等位基因特异性基因组PCR(Michalatos-Beloin S，et al.，Nucleic Acids Res 24：4841-4843，1996；和YuCE，et al.，Genomics 84：600-612，2004)；2)单倍型特异性分离(HSE)(NagyM，et al.，TissueAntigens 69：176-180，2007)；3)体单倍体细胞的产生，例如GMP转化(Douglas JA，et al.，Nat Genet 28：361-364，2001)；4)Polony(Mitra et al.，Proc Natl Acad Sci US A100：5926-5931，2003；Zhang K，et al.，Nat Genet 38：382-387，2006)；5)基于克隆的系统单倍型分型(CSH)(Burgtorf C，et al.，Genome Res 13：2717-2724，2003)；6)单分子稀释法(SMD)(Ding C，et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 100：7449-7453，2003)；以及7)精子分型。

长距离等位基因特异性基因组PCR使用专门设计的PCR引物以仅从姐妹染色体之一选择性地扩增靶区。通过设计引物使其3′端与等位基因之一匹配/错配来实现选择性扩增。因此，引物不能有效地扩增未匹配的染色体DNA模板。随后在扩增产物上进行基因型分型。由于这些PCR产物仅获自染色体之一，因此沿着这些PCR产物的不同SNP的等位基因显示出单倍型。

在本方法中，通过DNA制备中PCR能达到的最大长度和染色体完整性来确定单倍型中遗传标记的最大距离。因此，单倍型长度受PCR的能力限制，其对于长PCR约为40kb。该方法在技术上通常是有挑战性的，并且对于每个引物对都需要大量地优化PCR条件，以提高长PCR的扩增效率。通常推荐数个引物对和缓冲液的不同组合以优化PCR条件。然而，该方法不适用于单倍型的高通量分析。