[发明专利]鞣酸酶、编码其的基因及其制造法

说明书

技术领域

本发明涉及曲霉菌(Aspergillus)属微生物产生的新型鞣酸酶。具体涉及曲霉菌(Aspergillus)属产生的耐热性优异的鞣酸酶、编码其的基因、其制造方法及其用途等。

背景技术

鞣酸酶(鞣酸酰基水解酶、EC3.1.1.20)是水解鞣酸类的缩酚酸键的酶。在食品工业中，可用于防止茶类饮料的冷后浑(Cream down)、防止果汁饮料的沉淀、啤酒的澄清化等。

到目前为止，报道了许多由于细菌、酵母和丝状真菌导致的鞣酸酶的产生(非专利文献1)。丝状真菌中关于曲霉菌(Aspergillus)属和青霉菌(Penicillium)属的报道较多。对于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)来源的鞣酸酶，已经清楚了其酶化学的性质、氨基酸序列和编码其的基因(参照专利文献1、2、非专利文献2)。

专利文献1中记载的鞣酸酶的最适pH范围在5.0～5.5附近的弱酸性、最适温度范围在40℃附近，在超过60℃的高温下10分钟之内就失活。因此，在工业利用时，就形成了在特别限定的条件下的反应。专利文献2中记载的鞣酸酶的热稳定性优异，柠檬酸缓冲液(pH5.5)中，65℃10分处理后的残留活性在80％以上、最适温度范围为60～80℃，克服了专利文献1中记载的鞣酸酶的缺点，但只报道了在重组体中的生产，未确认非重组体中的生产。因此，在食品产业中利用时，按照“利用基因重组微生物制造的添加物的安全性评价基准”(非专利文献3)的安全性确认是必需的。此外，在日本，对基因重组食品的排斥性也根深蒂固。因此，还不能说可在食品产业中直接利用。

另一方面，也有关于最适温度在60℃以上的热稳定性优异的鞣酸酶的报道(参照非专利文献4、5)。但是，只是确认了存在这些鞣酸酶，但其氨基酸序列和编码其的基因、酶科学性质等还没弄清楚，无法实现实用化。

专利文献

专利文献1：特开平8-80196

专利文献2：特开2003-250588

非专利文献

非专利文献1：Appl.Microbiol.Biotechnol.，Vol.76，p.47-59，2007

非专利文献2：Gene，Vol.175，p.215-221，1996

非专利文献3：食品安全委员会“利用基因重组微生物制造的添加物的安全性评价基准”平成16年3月25日决定

非专利文献4：Microbiology，Vol.149，p.2941-2946，2003

非专利文献5：Process Biochemistry，Vol.40(5)，April 2005，p.1553-1557，2005

发明内容

本发明的目的在于提供来源于自然界中存在的微生物的、耐热性优异的鞣酸酶。而且，目的还在于提供该鞣酸酶的基因、制造方法、用途等。本发明人为了解决上述问题进行了积极的研究。其结果是，在黑曲霉(Aspergillus niger)的3个菌株和泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的2个菌株总共5个菌株中确认产生了耐热性高的鞣酸酶。进而继续进行研究，成功分离了泡盛曲霉(Aspergillus awamori)NBRC-4033(IFO-4033)产生的鞣酸酶，确定了其酶化学性质。此外，还成功鉴定了该鞣酸酶的氨基酸序列和编码该鞣酸酶的基因的碱基序列。将酶化学的性质和氨基酸序列与已经报道的鞣酸酶进行了比较，结果确认了成功获得并鉴定的鞣酸酶是新型酶。

本发明基于上述成果而完成，内容如下。

[1]一种鞣酸酶，来源于泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或黑曲霉(Aspergillus niger)，对于65℃的热处理(pH5.0、30分钟)具有耐性。

[2]一种鞣酸酶，具有下述酶化学性质：

(1)作用：作用于缩酚酸键而进行水解；

(2)分子量：约23万Da(通过凝胶过滤测定)；

(3)温度稳定性：直到65℃都稳定(pH5.0、30分钟)。

[3]根据[2]所述的鞣酸酶，还具有下述酶化学性质：

(4)最适温度：约70℃；

(5)最适pH：约5.5；

(6)pH稳定性：在pH3～8的范围稳定(30℃、30分钟)

(7)底物特异性：良好地作用于鞣酸，作用于没食子酸酯。

[4]根据[2]或[3]所述的鞣酸酶，来源于泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。

[5]一种鞣酸酶，具有序列号5所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列等价的氨基酸序列。