[发明专利]用于DMD的多外显子跳跃组合物

说明书

引用的相关申请

按照35 U.S.C.§119(e)的规定，本申请要求2008年10月24日提交的美国临时专利申请第61/108,416号的优先权，其中该临时申请通过引用整体并入本文。

关于序列表的声明

本申请提供了文本格式的相关序列表用于替代纸件拷贝，这些序列表通过引用并入本说明书中。含有这些序列表的文本文件的名称是120178_410PC_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为156KB，于2009年10月23日创建，是通过EFS-Web以电子方式提交。

发明领域

本申请涉及适合促进人肌营养不良蛋白基因的外显子跳跃的新反义化合物和组合物。还提供了使用适合用于本发明方法的反义组合物诱导外显子跳跃的方法。

发明背景

使用多种化学制剂在不同水平上(转录、剪接、稳定性、翻译)影响基因表达，发展了反义技术。这类研究中有许多在指征的宽泛范围内专注于使用反义化合物校正或补偿异常或疾病相关基因。反义分子能够特异性地抑制基因表达，因此，许多研究，其致力于作为基因表达调节剂的寡核苷酸，已关注于抑制靶向基因(targeted gene)的表达或顺式作用元件的功能。在一些病毒RNA靶标的情况下，反义寡核苷酸通常针对RNA，或正义链(如mRNA)或是负链。为了实现特定基因减量调节的期望效果，寡核苷酸通常促进靶向mRNA的降解，阻断mRNA的翻译或阻断顺式作用RNA元件的功能，由此有效地防止靶蛋白的从头合成或病毒RNA的复制。

然而，如果目的是上调天然蛋白的产生或补偿诱导翻译的提前终止的突变，例如无义或移码突变，则这些技术不起作用。在这些情况中，缺陷型基因转录物不会进行靶向降解(targeted degration)或空间抑制，所以反义寡核苷酸化学制剂不会促进靶mRNA降解或阻断翻译。

在许多遗传疾病中，突变对基因最终表达的影响可通过剪接过程中靶向外显子跳跃的过程进行调节。该剪接过程受复杂多成分机制的指导，该机制使mRNA前体(pre-mRNA)中的相邻外显子-内含子连接紧密相连并切割内含子末端的磷酸二酯键，伴随着它们在要剪接在一起的外显子之间的后续改造。这个复杂且高度精确过程是通过mRNA前体中的序列基元介导的，所述序列基元是相对半保守的RNA片段，参与之后剪接反应的许多核剪接因子都与其结合。通过改变剪接机制读取或识别参与mRNA前体加工的基元的方式，可以产生差异化的剪接mRNA分子。现在已认识到大部分人基因在正常基因表达过程中可选地剪接，尽管仍未鉴定出相关机制。

在正常功能蛋白因突变而提前终止的情况中，通过反义技术恢复一些功能蛋白产生的方式已经表明，在剪接过程通过干扰是可能的，并且如果与致病突变相关的外显子可被从一些基因中特异性地缺失，则有时会产生缩短的蛋白产物，其具有与天然蛋白相似的生物特性或具有足以改善由与外显子相关的突变导致的疾病的生物活性(Sierakowska，Sambade et al.1996；Wilton，Lloyd et al.1999；van Deutekom，Bremmer-Bout et al.2001；Lu，Mann et al.2003；Aartsma-Rus，Janson et al.2004)。Kole等(美国专利第5,627,274号、第5,916,808号、第5,976,879号以及第5,665,593号)公开了使用不会促进靶向mRNA前体降解的修饰的反义寡核苷酸类似物与异常剪接斗争的方法。Bennett等(美国专利第6,210,892号)描述了野生型细胞mRNA加工的反义调控也使用不会诱导RNAse H-介导的靶RNA切割的反义寡核苷酸类似物。

靶向外显子跳跃的过程可能特别可用于长基因，在所述长基因中，有许多外显子和内含子，有多余的外显子的基因组成或蛋白无需一个或多个特定外显子就能够发挥功能。使基因加工重定向用于治疗与各种基因中的突变所导致的截短相关的遗传疾病的努力，致力于使用以下反义寡核苷酸：其(1)与参与剪接过程的元件完全或部分重叠；或(2)在足够接近元件位置上与mRNA前体结合以阻止正常介导在该元件中发生的特定剪接反应的剪接因子的结合和功能。