[发明专利]利用内部校正定量检测RNA

说明书

发明技术领域

本发明属于生物学与化学领域。具体说，本发明属于分子生物学领域。更具体说，本发明属于核酸定量与实时PCR领域。此外，本发明涉及经校正的靶核糖核酸定量检测。

背景技术

核酸混合物中特定靶核糖核酸(本文中也称特定RNAs)的定量检测对分子生物学的许多应用，如基因表达分析、或核酸混合物中特定RNA的纯化至关重要。在定量检测方法中，需确定样品中特定RNA的浓度和/或相对或绝对含量。具体说，对于基因表达分析，例如测定生物样品中的mRNA水平，需要一种可重现和比较的方法。例如，不总是能获得具有相当体积、核酸含量、细胞材料等的生物样品。

此外，生物样品中核酸检测和定量的灵敏度和选择性至关重要。为了更好地比较两种或多种不同(生物学)样品中特定RNA的含量或者比较一个样品中两种或多种不同特定RNA的含量，必须把特定RNA的含量按输入核酸或输入核酸中的特定种类为基准进行校正。例如，特定RNA的含量可以通过将这些含量与样品中的内标或全部(即总)核酸量或样品中特定种类核酸的含量相关联而进行校正。

对于(生物学)样品中核酸的常规定量，广泛采用了定量(实时)PCR(qPCR)。对于RNA，具体是mRNA，本领域采用定量实时逆转录PCR(RT-qPCR)。已采用不同的方法对定量PCR方法得到的数据进行校正。将特定mRNA的含量按不同的参比基因，例如持家或保持基因如β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因、或者28S或18S核糖体RNA的一种或多种mRNA的含量进行校正就是其中一种方法。然而，已经发现这些校正基因的表达水平取决于实验条件、样品的制备和来源(如组织或细胞类型)而不同，因此它们不是输入核酸的可靠指示。所以，通常需要在费力易错的过程中测试各种不同的持家基因以鉴定在所研究的样品之间没有变化的那些基因。

其它方法有，例如，依靠DNA和/或RNA总量或如核糖体RNA(rRNA)总量进行的校正。由于生物细胞和样品中核糖体RNA的含量同样取决于多种因素而有差异，用rRNA校正也不太优选。本领域现有的依赖于按例如核酸总量、RNA总量或基因组DNA总量进行校正的方法也有局限性，如这些含量变化或核酸样品的质量有所不同。用外来或人造分子如掺入样品(如细胞抽提物或者组织衍生样品)中的体外转录产物进行校正也不总是充分的方案，因为它们不能代表细胞内的核酸(如基因组DNA、RNA、mRNA)含量。

此外，为了比较经校正的数据以及实验方案的重现性，需要对所用的实验条件编制详尽的文档。当分别测定或用不同方法测定感兴趣的核酸与校正核酸的含量时，这一点特别相关。

因此，本发明主要的技术问题是开发和提供一种改进的、特别是较不费力不易错的方法来校正靶核糖核酸的含量。

发明概述

本发明涉及一种定量测定样品中一种或多种靶核糖核酸的方法，包括以下步骤：

(i)提供包含所述一种或多种靶核糖核酸的样品；

(ii)在允许所述染料与所述样品中一种或多种核糖核酸结合的条件下，使所述样品与核糖核酸特异性荧光染料接触；

(iii)测定所述样品中所述RNA-结合染料的荧光；

(iv)将所述测得的荧光与样品中的RNA总量相关联；

(v)逆转录所述一种或多种核糖核酸，从而产生双链核酸；

(vi)扩增所述一种或多种产生的双链核酸，其中在扩增期间和/或之后，在允许一种或多种探针与样品中产生的所述一种或多种双链核酸结合的条件下，存在所述一种或多种扩增产物的一种或多种特异性荧光探针；

(vii)测定扩增期间和/或之后结合于所述一种或多种扩增产物的所述一种或多种探针的荧光，并把所述测得的荧光与样品中靶RNA序列的量相关联；

(viii)按样品中RNA的总量校正样品中靶RNA序列的含量。

样品至少含有需定量的核糖核酸的核酸分子。所述核酸可以包含在细胞或者生物体内，但也可以存在于无细胞系统中。样品可以是液体、裂解液、固体基质或其它含有核酸分子的任何物质。在本发明中，样品可以是所有生物组织和所有液体如淋巴液、尿液、脑液。组织可以是，例如上皮组织、结缔组织如骨骼或血液、肌肉组织如内脏或平滑肌和骨骼肌，以及神经组织。在一种实施方式中，样品是细胞培养物或细胞培养抽提物。